柚皮苷通过抗氧化机制促进干细胞成骨分化研究进展

齐玉成,王 华,2,陈 培,冯 华,杨旭芳

(1.牡丹江医学院基础医学院；2.牡丹江心血管病医院放射介入中心,黑龙江 牡丹江 157011)

随着中国老龄化的进程进入了加速期,骨质疏松症的发病率也呈现出逐年递增的趋势。骨质疏松症是一种以骨微结构破坏,骨代谢异常,骨折风险增加为特征的全身性疾病,严重影响了老年人的生活质量[1]。近年来,氧化应激作为衰老的基本机制之一,在年龄相关的疾病中显示着举足轻重的研究价值。现代医学研究证实了骨质疏松症与氧化应激之间存在着密不可分的联系[2]。中药骨碎补作为抗骨质疏松症药物在骨科的应用已有长达千年的历史,柚皮苷作为骨碎补的有效成分之一,具有抗氧化、原料廉价、副作用少、治疗骨质疏松症,促进骨折愈合等成效[1,3-4]。大量研究证实柚皮苷在成骨细胞的增殖分化中扮演着至关重要的角色,柚皮苷促进成骨细胞特异性基因表达的研究进一步确定了其在骨质疏松症治疗中具有不可或缺的地位。现就柚皮苷对成骨细胞增殖分化的药理作用及柚皮苷通过抗氧化机制促进成骨分化予以综述,为柚皮苷防治骨质疏松症的临床应用提供可靠的理论依据。

1 氧化应激与成骨分化

氧化应激是指体内自由基产生过多而导致的细胞损伤反应,表现为胞内活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)异常增高,细胞的抗氧化能力不足。骨微结构的形成与溶解吸收之间的协调平衡是骨形态维持的基础,衰老、炎症与雌激素分泌不足引起的氧化应激对骨形态有着不可忽略的影响。研究表明,氧化应激可以对成骨细胞增殖分化的全程均行使功能,其中包括抑制骨髓间充质干细胞及成骨前体细胞向成骨细胞分化,减少骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)等转录因子的表达[5],间接地抑制了细胞内BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信号轴的转录[6]。氧化应激除了直接或间接作用于成骨细胞的基因和蛋白质外还可以作为第二信使直接参与细胞内的信号通路,从而调控成骨细胞的增殖与分化。

2 柚皮苷对成骨细胞增殖与分化的药理作用

成骨细胞对骨的改建及重塑发挥着不容忽视的作用,成骨细胞以出芽的方式向类骨质中释放富含钙结合蛋白及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的基质小泡,促进类骨质钙化。张恩南等[7]体外诱导大鼠干细胞进行成骨分化显示,一定浓度的柚皮苷可以通过降低氧化应激促进成骨分化。Zhang XB等[8]证实体外培养犬骨髓基质细胞在柚皮苷的诱导下可以分化为成骨细胞,其中柚皮苷浓度为10-6mol/L时能够明显促进骨髓基质细胞的增殖及分化。与此同时,Zhang P等[9]通过不同浓度的柚皮苷与人骨髓间充质干细胞进行共培养,证实1～100 mg/L的柚皮苷溶液可以增强人骨髓间充质干细胞的增殖和分化。在体内成骨分化研究中,Li N[10]采用去势大鼠骨质疏松模型证实,使用300 mg/Kg浓度的柚皮苷灌药对大鼠骨密度及骨小梁的构建效果显著。

柚皮苷促进成骨分化不仅具有增强剂作用,而且还具有诱导剂作用。徐高丽等[11]利用不同浓度的柚皮苷单独作用于小鼠胚胎成骨细胞前体细胞,结果显示单纯的浓度为1×10-4mol/L的柚皮苷刺激能够最大程度上提高细胞增殖,促进碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、成骨细胞骨特异性转录因子2(Runt-related transcription factor2,Runx2)、Ⅰ型胶原等成骨相关基因表达。

柚皮苷对间充质干细胞向成骨方向定向分化具有促进作用,但最佳浓度尚存争议,目前主要集中于10-6mol/L～10-4mol/L之间。然而,无论是在体内还是体外进行成骨分化的诱导,柚皮苷的诱导效应均呈现低浓度无效,而高浓度细胞毒性的现象。

3 柚皮苷促进干细胞进行成骨分化的抗氧化分子机制

3.1 柚皮苷对成骨分化特异性转录因子的影响为进一步探讨柚皮苷促进成骨分化的作用机制,研究人员从基因水平对柚皮苷促进成骨分化进行了研究,研究发现柚皮苷主要上调间充质干细胞的Runx2,BMP及Osterix等基因表达。

3.1.1 Runx2 Runx2作为Runt基因家族的3个成员之一,在骨微环境的多种细胞中均有表达,参与骨代谢,在骨形成相关细胞中扮演着至关重要的角色,是一种成骨分化重要的转录因子[12]。Runx2通过结合细胞内启动子进而调控成骨相关基因如OCN、ALP等表达。Runx2作为早期成骨细胞分化的标志之一参与多条成骨分化通路的调节[13]。体外实验表明,Runx2不仅参与成骨细胞的分化与成熟,而且还与软骨细胞及多种骨代谢疾病有着密切联系[12]。Yin L等[14]通过研究柚皮苷在体外诱导人牙周膜干细胞的成骨分化过程中证实1×10-6mol/L的柚皮苷可以显著的提升Runx2、OCN和骨桥蛋白的表达水平 。

3.1.2 BMP BMP是上世纪60年代年由Urist首次提取到的成骨分化关键的胞外调控因子[15],主要在骨组织中高表达,其他组织分布较少。BMP经过旁分泌或自分泌的方式诱导成骨细胞的形成,其受体根据胞内区的不同将其分为Ⅰ型和Ⅱ型两种受体,BMP通过BMP/Smad等多种信号通路共同上调Runx2及Osterix的表达,从而促进成骨分化[16]。BMP-2在其家族中与成骨分化最为密切,已被广泛应用于骨组织工程的骨缺损修复,并取得令人满意的效果[17]。刘建林等[18]发现柚皮苷诱导干细胞骨向分化可能是通过上调BMP-2及Ⅰ型胶原酶等基因表达,该作用效果可能与BMP-2通路的激活有关。Wu等[19]发现柚皮苷可以增加BMP-2的mRNA及蛋白质水平,另外柚皮苷还可以抵御体内卵巢切除引起的BMP-2减少及骨流失[18]。

3.1.3 Osterix Osterix(OSX)是一种骨形成转录因子,通常在Runx2下游影响细胞的成骨分化及骨重塑。OSX蛋白具有锌指结构,可以插入到DNA的大沟中直接调控DNA的转录[20]。当前研究表明,OSX只在骨组织中表达,对干细胞向成骨细胞分化起决定性作用[21]。缺乏OSX基因的小鼠由于缺少软骨内成骨与膜内成骨引起成骨细胞来源减少,同时各种成骨分化标志物的表达水平也严重下降或者缺失,这些标志物包括Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、OCN等[22]。Zhai等[23]对柚皮苷体外诱导乳鼠成骨细胞分化进行检测,证实柚皮苷具有提高Osterix和Runx2进而促进成骨细胞增殖和分化成熟的能力,在加入雌激素通路抑制剂后表现为柚皮苷的促进作用消失,这表明柚皮苷可能是一种具有抗氧化作用的植物雌激素。

事实上,这三种重要的成骨细胞转录因子之间休戚与共,一损俱损。三种转录因子均可以作为诸多信号通路的参与者,同时也可以作为某些信号通路的靶点,共同调控干细胞增殖和骨向分化。

3.2 柚皮苷通过抗氧化对成骨分化信号传导的影响氧化应激是造成组织损伤的基础之一,表现为胞内过量的氧自由基及过氧化氢等,这些活性氧类物质与胞内分子相互作用产生细胞毒性,形成瀑布样反应,进一步造成细胞损伤。成骨细胞作为骨形成的基础,对氧化应激高度敏感,柚皮苷对干细胞成骨分化的抗氧化作用所涉及的主要信号通路如下。

3.2.1 BMP-2/Smads/Runx2信号轴 BMP-2属于一种成骨细胞的胞外关键调控因子。BMP-2可以通过经典的Smads和非经典的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)两种通路进行调控[24]。经典通路中BMP-2配体-受体结合将RSmads进行磷酸化,磷酸化的RSmads与Co-Smads形成复合物入核并结合靶基因的启动子启动Runx2的表达,Runx2还可以通过调节多种成骨特异基因促进骨的重塑[13]。非经典的BMP-2通路主要通过与MAPK等信号通路相互交联从而发挥作用[24]。研究发现,Ti颗粒诱导后的氧化应激小鼠成骨前体细胞明显下调了BMP-2/Smads/Runx2信号轴,从而降低了成骨分化的效率[25]。宁宇[26]采用最佳浓度的柚皮苷处理间充质干细胞并从分子水平对该信号轴进行检测,结果表明柚皮苷能够通过此信号轴提高成骨细胞转录因子的表达从而促进间充质干细胞成骨分化。这间接地证明了柚皮苷是可以通过此信号轴发挥抗氧化效用进而促进骨形成。

3.2.2 PI3K/AKT通路 磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinsae,PI3K)是一种多功能酶,可以接受G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体的激活,是细胞增殖、衰老和凋亡的重要参与者。在调控成骨分化和骨生成中,PI3K/AKT通路有着举足轻重的地位[27]。ROS可以直接作用于该通路从而激活AKT[28],活化后的AKT可引起下游因子如糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、叉头型转录因子(FoxO)、BMP等的变化,处于PI3K/AKT信号通路的核心位置,影响成骨细胞和破骨细胞的生成与分化,对血管修复也有一定影响,发挥调理骨量和骨强度的效用[29-30]。Wu[19]的实验分析表明,柚皮苷对BMP-2的转录调控是通过AKT的磷酸化和激活蛋白1(AP-1)组分c-Fos和c-Jun的激活介导的。PI3K/AKT作为细胞内众多信号的汇聚点,与多种信号通路的位点均有联系,但是PI3K/AKT通路如何调控其他通路的各级信号分子,以及能否较其他通路抗氧化能力更加高效,值得进一步探索。

3.2.3 Wnt通路 Wnt/β-catenin是一类在进化过程中调控细胞生长、分化、衰老和凋亡的保守通路。根据是否有β-catenin的参与可以将其通路分为经典Wnt通路与非经典Wnt通路,不同的Wnt蛋白激活的Wnt通路各不相同[31]。经典Wnt信号通路中,Wnt蛋白促使胞内β-catenin磷酸化,磷酸化的β-catenin进入细胞核与T细胞因子/淋巴样增强因子家族转录因子相互作用,上调靶基因Runx2 和Osterix等的表达,促进成骨分化[32]。非经典Wnt通路对经典Wnt通路具有负反馈的作用,该通路激活可以抑制干细胞的增殖,因此不同环境下Wnt通路的激活将影响着干细胞分化的方向[31]。Wnt通路不仅调控骨向分化,对成骨细胞的活性、转录因子的表达、骨微结构的构建均具有直接调节作用。新近研究显示,糖尿病引起的氧化应激导致成骨细胞功能障碍,并伴随Wnt/β-catenin信号的失活[33]。Liu M等[34]研究结果表明,1～100 mg/L的柚皮苷可通过Wnt通路促进人羊绒膜源性干细胞的成骨作用,柚皮苷可以经过BMP途径抑制破骨细胞生成,并且通过BMP与Wnt两个通路共同促进干细胞的成骨作用。Wang L等[35]使用柚皮苷成功逆转了H2O2诱导的转录因子β-catenin蛋白表达下降。此外,在Wnt抑制剂DKK-1作用下,柚皮苷不再有效提高暴露于H2O2的成骨细胞中ALP活性及钙含量,并下调了RUNX2和OSX的mRNA表达。

柚皮苷可通过调节Wnt/β-catenin通路促进成骨分化,同时又有研究报道ROS/FoxO为氧化应激的主要调控通路[36],但柚皮苷是否通过抑制ROS/FoxO通路,从而促进Wnt通路介导的成骨分化尚未见报道。

3.2.4 MAPK通路 MAPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[37]。MAPK的激活经过三级级联反应依次激活。MAPK主要包括胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)家族、c-Jun N端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)家族、p38蛋白激酶(p38MAPK,p38)家族[38]。ERK信号通路是MAPK通路中研究最为彻底的通路,激素、生长因子、机械力刺激等均可以促进ERK活化,该通路主要影响着细胞的分化成熟[39]。JNK及p38通路经过细胞外的应激刺激激活,二者又称MAPK应激信号通路,对细胞凋亡有着至关重要的作用[40-41]。三种通路在细胞分化生长的不同时期表达活性不同。Wang Y[42]证明H2O2显著降低了人骨髓间充质干细胞的增殖和成骨细胞分化。进一步的研究结果表明,MAPK通路的激活对成骨细胞氧化应激作用有着至关重要的影响。最新研究结果显示柚皮苷主要是通过激活MAPK信号通路中ERK1/2通路来增强间充质干细胞骨向分化。Wang H等[43]实验表明0.1g/L的柚皮苷可以显著促进干细胞成骨分化并提高成骨细胞的矿化,使用ERK1/2MAPK通路抑制剂U0126进一步证明柚皮苷可以逆转被U1026阻断引起的Runx-2和OSX的低水平表达。Wei K等[44]通过免疫印迹对MAPK信号通路检测的结果显示,柚皮苷主要通过ERK1/2MAPK通路促进人牙周膜干细胞成骨分化,而JNK及p38没有明显改变。但是又有研究报道MAPK中的p38和JNK均可促进成骨分化和BMP-2的表达[45],因此对于MAPK的研究尚存争议,需要广大学者进一步研讨。

以上研究表明,衰老,雌激素分泌不足等原因引起的氧化应激已成为诱发骨质疏松症的一个高危因素,机制复杂,诸多机制尚未厘清。柚皮苷通过BMP信号轴及PI3K/AKT通路发挥抗氧化效用以促进骨形成还需要进一步的研究。许多研究者已经证实抗氧化剂在骨形成方面存在着不可磨灭的功效。骨向分化所涉及的信号通路多而复杂,相互协调,一个通路的阻断就可能降低其他通路的成骨效应,增强骨流失。

4 小结

骨质疏松症已成为全球性的健康和社会问题,严重影响老年人的生存质量。氧化应激作为机体衰老的基本病理机制之一,对骨质疏松症的产生扮演着至关重要的角色。柚皮苷在抗氧化治疗骨质疏松症方面表现了巨大的临床应用潜力。氧化应激对成骨分化的影响机制尚未完全阐述清楚,但氧化应激主要通过BMP-2,Wnt,PI3K/AKT及MAPK等通路影响成骨分化,并且以上通路可以相互作用相互影响,形成一个精细庞大的调控网,共同调节成骨分化的相关基因。这表明骨质疏松症的治疗需要多个靶点多种机制共同调控。但是当前学者大多仅对柚皮苷促进成骨分化相关蛋白及其单条通路的研究鞭辟入里,对各通路之间的相互作用略见一斑。因此,在此方面需要更多的学者笃志学习、深入探索,使骨质疏松症等病症得到更好的控制,让更多的人摆脱疾病,重铸健康生活。