聚β-羟基丁酸酯来源及其在水产养殖中的应用

杨 静，白 璐，马红丽，王一婷，郭思聪，叶仕根

( 大连海洋大学，农业部北方海水增养殖重点实验室，大连市海珍品疾病防控重点实验室，辽宁 大连 116023 )

聚β-羟基丁酸酯(poly-β-hydroxyalkanoates, PHB)是发现最早的一种聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate, PHA)，属于聚酯类化合物。1925年法国学者Lemoigne首次在巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)细胞中发现分离并提取出了聚β-羟基丁酸酯[1]。聚β-羟基丁酸酯具有热塑性、组织亲和性、光学活性、生物可降解性和生物相容性等多种优良特性，同时还可利用再生资源进行生物合成，在工业、环保、医药等领域有广泛应用[2]。有研究表明，聚β-羟基丁酸酯常在营养不均衡的条件下作为微生物细胞中能量和碳的来源[3]。此外，聚β-羟基丁酸酯可以促进水生动物的生长，提高存活率，抑制致病性弧菌的生长[4]。笔者综述了聚β-羟基丁酸酯的生物合成与化学合成及其在水产养殖中的应用现状，并展望了聚β-羟基丁酸酯在水产养殖中的应用前景及发展趋势。

1 聚β-羟基丁酸酯的来源

聚β-羟基丁酸酯由于其良好特性，在工业、环保、医药等方面应用广泛。目前，聚β-羟基丁酸酯主要来源于生物合成和化学合成。

1.1 生物合成与提取

1.1.1 聚β-羟基丁酸酯的生物合成

聚β-羟基丁酸酯的生物合成方式主要有微生物发酵、活性污泥合成和基因工程手段介导的植物合成等3种方式，其中微生物发酵是最常见的合成方式。现已发现有300 多种能产生聚β-羟基丁酸酯的微生物，包括光能自养、化能自养和异养菌，但尚未发现能产生聚β-羟基丁酸酯的真核生物。目前，用于生产的菌种主要是真养产碱杆菌(Alcaligenescastellani和A.chalmers)和假单胞菌(Pseudomonas)等[5]。除了微生物发酵生产聚β-羟基丁酸酯以外，还可以采用活性污泥合成聚β-羟基丁酸酯。利用活性污泥生产聚β-羟基丁酸酯最早是由Satoh等[6]提出，利用活性污泥生产可以降低生产成本，但是合成聚β-羟基丁酸酯含量低，纯度不高。Li等[7]研究了在厌氧/好氧间歇式反应器中不同营养条件对聚β-羟基丁酸酯积累的影响，结果表明，氧气、氮含量、磷含量等对聚β-羟基丁酸酯的积累有影响，好氧条件时，限制氮和磷含量，聚β-羟基丁酸酯积累量可以达到60.4%。同微生物发酵相比，植物可利用自身丰富的碳源形成具有活性的分子。因此许多研究小组利用基因工程将微生物编码聚β-羟基丁酸酯合成相关酶导入玉米、棉花、拟南芥、马铃薯、烟草、油菜等植物后合成聚β-羟基丁酸酯[8]，降低了生产成本。有研究表明，后期聚β-羟基丁酸酯的大量积累会抑制植物的生长，同时植物生长到后期，聚β-羟基丁酸酯积累能力会减弱[9]。

生物合成对来源菌株要求很高，菌株性能直接影响到后续聚β-羟基丁酸酯的生产。因此聚β-羟基丁酸酯菌株的筛选以及诱变选育显得尤为重要。生活污水和污泥是最常见的聚β-羟基丁酸酯菌株的分离来源，已从中分离出芽孢杆菌属(Bacillus)[10]、假单胞菌属[11-12]、固氮菌属(Azotobacter)[13]和肠杆菌属(Enterobacter)[14]等菌株。土壤也是较为常见的菌株分离来源，已从中分离到的细菌有芽孢杆菌属[15]、埃希氏菌属(Escherichia)[16]、假单胞菌属[17]、红球菌属(Mycobacteriumrhodochrous)[18]等。Nazila等[12]自一啤酒厂的废水出口处分离出6种产聚β-羟基丁酸酯的细菌，其中产聚β-羟基丁酸酯最高的菌株为苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。Gabr[15]自土壤样品中分离到一株以枣椰树糖浆为碳源且高产聚β-羟基丁酸酯的芽孢杆菌。虽然已通过试验筛选获得很多优良的菌株，但是距离生产应用还有一定差距，因此，诱变选育成为一种获得良好性状和性能菌株的重要途径。常用的诱变方法主要有物理诱变和化学诱变两种类型。物理诱变手段主要有紫外线、超声波、激光等，化学诱变手段主要采用硫酸二乙酯、亚硝酸等[19]。季爱云[20]采用紫外诱变处理方法对动胶菌(Ramigera)进行了诱变选育，获得比原始菌株含量高36.84%的突变株。崔晓红[21]采用紫外线与亚硝酸钠复合诱变方法获得聚β-羟基丁酸酯含量高、遗传较稳定的突变株。刘俊梅等[22]采用紫外线和硫酸二乙酯复合诱变选育,聚β-羟基丁酸酯产量达15.94 g/L的高产菌株。孔芳等[23]采用常压室温等离子体对芽孢杆菌属菌株进行快速诱变，聚β-羟基丁酸酯含量达77.43%，产量2.78 g/L，是原始菌株的2倍。

1.1.2 生物合成的聚β-羟基丁酸酯的提取

生物合成的聚β-羟基丁酸酯需经进一步提取才能获得应用性的聚β-羟基丁酸酯。聚β-羟基丁酸酯提取方法主要有化学试剂法、物理破壁法、酶降解法等[24]。目前实际生产中一般是将上述方法中的2种或3种结合使用来提高聚β-羟基丁酸酯的提取效率。

化学试剂法是采用有机溶剂、表面活性剂、氧化(或还原剂)和螯合剂等从细胞等物质中萃取分离，去除杂质，获得较高纯度的聚β-羟基丁酸酯。有机溶剂萃取法是利用聚β-羟基丁酸酯可以溶解于某些有机溶剂不溶于水的特性来分离聚β-羟基丁酸酯。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、1,2-二氯乙烷、1,2-丙烯碳酸盐和丙酮等[25]。氧化剂(或还原剂)如次氯酸钠可氧化还原细胞中的物质，但聚β-羟基丁酸酯不受影响。鳌合剂可与细胞膜上的钙镁离子络合从而破除细胞壁，释放聚β-羟基丁酸酯。常用的螯合剂有DTPPA、EDTA等[26]。化学试剂法提取聚β-羟基丁酸酯纯度较高，但是在制备过程中使用了大量的有毒或挥发性溶剂，易造成安全隐患和环境污染。

物理破壁法采用高压匀浆法或高速珠研磨法对细胞破壁，释放出聚β-羟基丁酸酯颗粒。Tamer等[27]比较高压匀浆法和高速珠研磨法发现，高压匀浆法与生物量浓度有关，对聚β-羟基丁酸酯损耗较大。高速珠研磨法能够减小聚β-羟基丁酸酯的损耗，与生物量浓度无关。物理方法对环境污染小，但是细胞破壁后聚β-羟基丁酸酯与杂质分离较难，因此多数研究使用物理法破壁后会结合溶剂萃取法等去除杂质获得高纯度的聚β-羟基丁酸酯。

酶降解法是利用酶将细胞中除聚β-羟基丁酸酯以外的物质降解为可溶性的小分子物质从而分离提取聚β-羟基丁酸酯[28]。酶法避免了大量有机溶剂的使用，对环境污染小，但提取步骤多，聚β-羟基丁酸酯纯度不高[26]。

1.2 化学合成

生物合成法合成聚β-羟基丁酸酯的过程中，因其自身的工艺和操作条件等出现了菌株生长周期长、产量低、聚β-羟基丁酸酯提取困难等问题，导致聚β-羟基丁酸酯生产成本较高。因此，化学法合成聚β-羟基丁酸酯是开发生产聚β-羟基丁酸酯的另一条途径。化学合成通常是在制备不同单体基础上经过不同方法聚合来生产聚β-羟基丁酸酯。常见单体有β-丁内酯、3-羟基丁酸乙酯和3-羟基丁酸。有研究发现，采用3-羟基丁酸乙酯、3-羟基丁酸两种单体缩合聚合可以制备较低分子量的聚β-羟基丁酸酯。由于缩合聚合时3-羟基丁酸乙酯和3-羟基丁酸两种单体会产生单官能团的物质，阻止相对分子质量的提高，因此，利用这两种单体难以制备相对分子质量较高的聚β-羟基丁酸酯。采用β-丁内酯开环聚合可以制备具有一定构型且相对分子量较高的聚β-羟基丁酸酯[29]。Seebach等[30]提出了以3-羟基丁酸为原料制备聚β-羟基丁酸酯，利用酸—氯偶联反应保护羟基和羧基、一步聚合后分别去除t -丁酯保护基团和苯醚保护基团，最后进行后耦合程序这4个反应，结果表明聚合物的聚合度只能达到3。杨文超[31]通过钛酸四丁酯催化3-羟基丁酸乙酯以熔融缩聚的方式获得聚β-羟基丁酸酯。Ebrahimi等[32]以二氨基酚盐配体为载体的锌配合物催化β-丁内酯发生聚合反应，获得了高分子量的聚β-羟基丁酸酯。采用化学合成法制备聚β-羟基丁酸酯可以提高聚β-羟基丁酸酯的产量，但是制备过程较为复杂，反应条件较为苛刻，副反应较多，易对环境造成二次污染。

2 聚β-羟基丁酸酯在水产养殖中的应用

聚β-羟基丁酸酯由于其良好特性，在工业、环保、医药等领域有广泛应用。Defoirdt等[33]等研究了聚β-羟基丁酸酯保护卤虫抵抗致病性弧菌的影响，这是聚β-羟基丁酸酯应用于水产养殖中的首次报道。此后，在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[34]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[35]、欧洲舌齿鲈(Dicentrarchuslabrax)[36]、贻贝[37]和中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[38]等水产动物上陆续进行了新的研究并取得较好效果。段亚飞等[39]报道了聚β-羟基丁酸酯在水产动物中的应用研究概况。笔者在此基础上对聚β-羟基丁酸酯在水产养殖中应用研究的最新进展进行了进一步总结。目前看来，聚β-羟基丁酸酯在水产养殖中的应用作用主要体现在促进水产动物生长，增强免疫和水质调控3个方面。

2.1 促进生长

段亚飞等[39]综述了聚β-羟基丁酸酯对中华绒螯蟹、中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)和西伯利亚鲟(Acipenserbaeri)等水生动物生长性能的影响，认为聚β-羟基丁酸酯能够改善动物消化酶活性，增加肠道消化吸收的表面积，从而促进动物生长。Silva等[40]研究了聚β-羟基丁酸酯对凡纳滨对虾肠道组织、消化酶活性和营养消化率的影响，发现试验组肠道淀粉酶、蛋白酶、胰蛋白酶活性均升高，脂类和多糖消化率提高，肠绒毛长度和宽度增加，表明聚β-羟基丁酸酯能够提高消化酶活性的表达，增加肠道消化吸收的表面积，提高凡纳滨对虾的消化吸收能力，进而促进动物生长。Duan等[41]也发现聚β-羟基丁酸酯能够增加肠上皮细胞的高度，促进肠道消化吸收，且最适添加量为3%。

聚β-羟基丁酸酯可以在动物肠道中降解成短链脂肪酸，降低肠道pH[42]，促进有益菌的增殖[39]，影响肠道微生物的丰富度和多样性[43-44]，提高动物的质量增加率和特定生长率[45]，进而促进动物的生长。此外，饲喂时间对于动物肠道微生物菌群丰富度也有一定的调节作用[46]。Duan等[47]研究发现，随着聚β-羟基丁酸酯含量的升高，凡纳滨对虾肠道微生物多样性降低，肠道中芽孢杆菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus)等有益菌的菌群丰度提高。Gao等[48]研究与之相似，发现可以大量积累聚β-羟基丁酸酯的盐单胞菌不仅可以抑制凡纳滨对虾肠道微生物弧菌的增殖，还能促进芽孢杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖。

此外，研究发现，β-羟基丁酸单体可以作用于肠道上皮细胞，诱导细胞分化，促进个体生长和脂肪酸积累，进而影响产卵和孵化[49]。张恒恒等[49]研究了聚β-羟基丁酸酯对中国明对虾亲虾繁殖性能和幼体发育的影响，结果发现，添加量为2%时，对虾亲虾终末体质量、质量增加率、特定生长率、产卵量和无节幼体数量均高于对照组，结果表明，饲料中添加聚β-羟基丁酸酯能够促进中国明对虾亲虾的繁殖性能和幼体发育。

2.2 增强抗病力

聚β-羟基丁酸酯可以激活动物的免疫系统，提高非特异性免疫能力，抑制病原微生物的生长，增强机体抵抗力。聚β-羟基丁酸酯能够改善中国明对虾、欧洲舌齿鲈和西伯利亚鲟等水产动物的免疫功能，通过诱导非特异性免疫基因的表达，激活动物的免疫系统，来提高非特异性免疫能力[39]。Laranja等[50]采用富含聚β-羟基丁酸酯的芽孢杆菌投喂斑节对虾(Penaeusmonodon)幼虾后，发现聚β-羟基丁酸酯积累的芽孢杆菌能够刺激对虾的天然免疫相关基因，特别是proPO和TGase基因。在弧菌攻毒后，各组对虾HSP 70表达均显著升高。聚β-羟基丁酸酯能够提高免疫酶活性，增强动物的抗病力。张恒恒等[51]研究了不同含量聚β-羟基丁酸酯对中国明对虾非特异性免疫酶的影响，结果发现，聚β-羟基丁酸酯添加量为1%时，总抗氧化能力、酸性磷酸酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶5种酶活力与对照组差异显著(P<0.05)，说明聚β-羟基丁酸酯能够提高中国明对虾的免疫水平，最适添加量为1%。Duan等[41]的研究与之相似，总抗氧化能力和溶菌酶活性升高，Toll 基因和HSP70 基因表达上调，表明聚β-羟基丁酸酯能够增强凡纳滨对虾的非特异免疫能力。此外，聚β-羟基丁酸酯能够提高抗菌肽的表达，增强动物的抗病力。Franke等[36]研究了聚β-羟基丁酸酯对欧洲鲈鱼幼鱼免疫刺激的影响。结果表明，聚β-羟基丁酸酯能够刺激鱼类早期阶段的免疫系统，提高抗菌肽dicentracin、Hepcidin、mhc class Ⅱa和mhc class Ⅱb的表达水平，推测这可能是聚β-羟基丁酸酯可以增强抵抗力和提高存活率的原因。Hung等[52]的研究与之相似，采用溶珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)攻毒后，发现酚氧化酶活性升高，4种抗菌肽基因的表达量均上调，表明聚β-羟基丁酸酯能够增强紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)的抗病力。聚β-羟基丁酸酯能够降低肠道pH，抑制病原微生物的生长[39]，增强机体抵抗力。Nhan等[53]研究了聚β-羟基丁酸酯对罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)的影响，结果发现，聚β-羟基丁酸酯可以抑制潜在病原微生物的生长，提高罗氏沼虾存活率。Ludevese-Pascual等[54]研究了聚β-羟基丁酸酯对斑节对虾的影响，使用坎氏弧菌(V.campbellii)攻毒后，发现投喂强化后的卤虫累计死亡率较对照组减小了35%。Sui等[38]的研究与之相似，添加聚β-羟基丁酸酯的中华绒螯蟹溞状幼体的存活率较对照组高出14%，同时使用鳗弧菌(V.anguillarum)攻毒后继续投喂，其存活率较对照组高出12.2%。Hung等[52]研究了聚β-羟基丁酸酯对紫贻贝的影响，发现在使用溶珊瑚弧菌(V.coralliilytius)攻毒后，其存活率高出对照组12%。Defoirdt等[55]研究了聚β-羟基丁酸酯对弧菌毒力因子的影响，结果表明，聚β-羟基丁酸酯通过降低弧菌溶血素、磷脂酶和蛋白酶等不同毒力因子的产生，抑制菌株的毒力，从而提高动物的存活率。

2.3 调控水质

聚β-羟基丁酸酯是菌株在去除污染物过程中所需碳源和能量的中转站[56]，是活性污泥除磷、脱氮过程中主要的碳源和能量源[57]。

Kuba等[58]研究发现，反硝化聚磷菌和好氧聚磷菌聚磷作用机理较为相似，在厌氧条件下，细菌利用多聚磷酸盐吸收有机酸在细胞中形成聚β-羟基丁酸酯，并将多余的磷酸盐释放，在好氧条件下，细菌氧化聚β-羟基丁酸酯产生能量，将过量摄取的磷酸盐储存在细胞中。田淑媛等[59]研究了在厌氧条件下，聚β-羟基丁酸酯的合成与聚磷酸盐释放二者之间的关系，其结果与之相似，同时发现聚β-羟基丁酸酯的合成与化学需氧量的去除正相关。郑宗林等[11]利用反硝化聚磷菌的聚磷作用机理，在底泥中筛选出一株具有合成聚β-羟基丁酸和多磷酸盐的反硝化聚磷菌。进一步表明污泥废水高效去磷的主要原因是在厌氧条件下大量合成聚β-羟基丁酸酯和好氧条件下聚磷菌大量吸收磷酸盐。此外，污泥转移量对胞内聚合物聚β-羟基丁酸酯的合成有显著影响。研究发现，过量的污泥转移会降低聚β-羟基丁酸酯的合成，促进糖原的合成，降低磷的去除率[60]。在适当的污泥转移比下，活性污泥可以合成足够的聚β-羟基丁酸酯，提高除磷能力，从而更好的进行水质调控。邓猛等[61]研究了当污泥转移量为15%、30%、40%时厌氧释磷和好氧吸磷的情况，结果表明，聚β-羟基丁酸酯的合成与磷的释放趋势相同。污泥转移量为30%时除磷效果最好，去除率为96.7%。

聂毅磊等[62]对两株可以大量产聚β-羟基丁酸酯的好氧反硝化菌和复合菌水质净化的能力进行研究，结果表明，40 h内总氮去除率分别为 9.20%、17.16% 和 32.84%，复合菌比单菌脱氮效果更好。Ruan等[63]将生物絮凝技术结合序批式间歇活性污泥法研究了不同氧气条件下养殖废水絮凝体对聚β-羟基丁酸酯富集的影响，优化絮凝体生物量、厌氧培养时间等条件后，发现在可持续的水产养殖生产中使用能够适当积累聚β-羟基丁酸酯的生物絮团，可以增加潜在的益生元价值，提高氮的去除率。Ludevese-Pascual等[64]研究了以聚β-羟基丁酸酯为基础的人工基质在凡纳滨对虾养殖中对水质的影响，在72 h后，发现使用聚β-羟基丁酸酯基质的试验组总氨氮含量为(0.35±0.04) mg/L,不使用基质总氨氮含量为(1.28±0.06) mg/L和使用PVC基质的总氨氮含量为(1.23±0.10) mg/L，表明以聚β-羟基丁酸酯为基础的人工基质可以显著降低凡纳滨对虾养殖水体的总氨氮含量，从而保持良好水质。

3 展 望

聚β-羟基丁酸酯是一种重要的聚酯类化合物，广泛应用于工业、环保、医药等领域，在水产养殖中也表现出较好应用效果。目前，已有研究证实，聚β-羟基丁酸酯可以抑制病原微生物生长，增强动物非特异性免疫能力，提高免疫酶活性，但增强免疫作用和提高抗病的详细机制仍不明确，还需进一步探索。此外，聚β-羟基丁酸酯在水产动物应用研究较少，其在不同物种使用效果、作用机制、使用时间、最适添加量等研究尚不明确，是下一步需关注的重点。其次，聚β-羟基丁酸酯是活性污泥除磷脱氮过程中主要的碳源和能量源，因此培养大量积累聚β-羟基丁酸酯的反硝化聚磷菌为主体的高效菌株，结合生物絮团工艺应用在废水处理中也许是一个新的研究热点。最后，在聚β-羟基丁酸酯生产方面，虽然目前聚β-羟基丁酸酯已能较大规模生产，但是还存在菌株聚β-羟基丁酸酯产量较低，合成成本较高等问题，有必要进一步加强菌株的筛选和诱变选育工作，优化生物合成产生工艺，从而进一步提高聚β-羟基丁酸酯产量，降低成本。