高邮湖大银鱼、太湖新银鱼Cytb和COⅠ基因序列多态性分析

李大命，孙文祥，许 飞，唐晟凯，刘燕山，谷先坤，刘小维，张彤晴

( 1.江苏省淡水水产研究所，江苏省内陆水域渔业资源重点实验室, 江苏 南京 210097; 2.江苏省高宝邵伯湖渔业管理委员会办公室，江苏 扬州 225009 )

大银鱼(Protosalanxhyalocranius)和太湖新银鱼(Neosalanxtaihuensis)均为一年生小型鱼类，分别属鲑形目、银鱼科的大银鱼属和新银鱼属，主要分布在我国黄河、淮河和长江中下游及其附属湖泊[1]。银鱼营养价值和经济价值均很高，是我国重要的经济鱼类。银鱼是典型的r-选择物种，个体小，对环境变化敏感，种群消长快。近几十年来，由于围湖造田、过度捕捞、环境污染等多种不利因素的影响，银鱼天然资源持续衰退，分布范围显著缩小，个别物种渐危[2]。因此，加强银鱼资源保护势在必行。

目前，有关银鱼的研究主要集中在移植增殖、生殖发育、种群生态、营养价值等方面[3-9]，而有关银鱼的分子生物学研究资料较少。遗传多样性决定了物种的进化潜能和对环境变化的适应能力，是生物多样性的一个重要方面。鱼类线粒体DNA是一种闭合、环状的双链DNA分子，具有结构简单、母系遗传、不发生重组及进化速度快等特征，使其成为分子群体遗传学和分子系统学研究的重要分子标记[10]。线粒体细胞色素b (Cytb)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因是线粒体DNA的蛋白质编码序列，具有进化速度较快、易扩增等优点，适用于种群水平遗传多样性的检测，已被广泛地应用于鱼类分子系统学和种群遗传学研究[11-13]。

高邮湖是全国第六大淡水湖、江苏省第三大淡水湖，水域面积780 km2。高邮湖具有渔业生产、工农业及生活用水、航运、旅游、泄洪行洪等多种功能，是具有丰富的生物多样性和较高生产力的生态系统[14]。高邮湖有鱼类63种，其中银鱼是高邮湖重要的渔业资源之一，也是渔民主要的捕捞对象[15]。近几十年来，受生态环境污染、不合理渔业生产方式及涉湖、涉渔工程建设的影响，高邮湖渔业资源量显著下降，渔业可持续发展受到严重威胁[15]。迄今为止，有关高邮湖鱼类的遗传学资料较少。有文献报道了高邮湖日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)和湖鲚(Coilianasus)群体的遗传多样性水平[16-17]，但尚未见有关银鱼遗传多样性的研究报道。本研究采用线粒体DNA Cytb和COⅠ基因序列作为分子标记，对高邮湖大银鱼和太湖新银鱼2个银鱼种群遗传多样性开展研究，一方面有利于丰富银鱼的分子生物学资料，另一方面可以为高邮湖银鱼种质资源保护及合理利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集和处理

2018年8—12月，在高邮湖水域采集大银鱼和太湖新银鱼各40尾。经测量，大银鱼体质量1.6359～5.6104 g，平均为3.3236 g；体长7.33～11.09 cm，平均为9.08 cm。太湖新银鱼体质量0.3674～1.2067 g，平均为0.6737 g；体长4.12～6.19 cm，平均为4.93 cm。剪取每尾个体的背部肌肉组织放入装有无水乙醇的离心管中，带回实验室置于冰箱-20 ℃保存备用。

1.2 DNA提取、PCR扩增及测序

剪取银鱼肌肉组织约50 mg，超纯水冲洗2次，用灭菌吸水纸吸干水分。采用广谱性基因组提取试剂盒(Takara,中国)提取DNA。用1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA质量和含量，-20 ℃保存备用。

大银鱼、太湖新银鱼线粒体Cytb基因扩增引物为：L14321，5′-CCAGTGACTTGAAAAACCACCG-3′，H15634，5′-CTTAGCTTTGGGAGTTAAGGGT-3′[18]； COⅠ基因扩增引物为：F1，5′-TCAACCAAC CACAAAGACATTGGCAC-3′，R1，5′-TAGACTTC TGGGTGGCCAAAGAATCA-3′[19]。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应总体积为50 μL，其中10×Buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L) 5 μL，正反引物各2 μL(10 μmol/L)，Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0.4 μL，DNA模板25 ng，ddH2O补足体积。样品在Eppendorf PCR仪上进行扩增。Cytb基因的反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃最后延伸10 min。COⅠ基因的反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，72 ℃最后延伸5 min。

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，送上海生工生物工程有限公司进行双向测序，测序引物与扩增引物相同。

1.3 数据分析

利用BioEdit软件[20]对测序所得序列进行拼接并辅以人工校对，通过BLAST (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索确定为目的片段。应用Mega 7.0软件[21]对所有序列进行多重比对，统计碱基组成及变异位点。采用Kimura双参数模型计算单倍型间的遗传距离，基于邻接法构建单倍型分子系统进化树。利用DnaSP 5.1软件[22]计算单倍型数、单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数。应用Arlequin 3.5.1.2软件[23]进行Tajima′sD和 Fu′sFs中性检验，同时结合核苷酸不配对分布图分析种群历史动态。

2 结 果

2.1 大银鱼和太湖新银鱼Cytb和COⅠ基因序列变异分析

经PCR扩增、测序和校对，获得高邮湖大银鱼线粒体Cytb基因全长序列(1141 bp)。Cytb基因序列中碱基组成平均含量为：A(21.7%)、G(16.7%)、C(32.3%)和T(29.3%)，碱基A+T的含量(51.0%)略大于碱基G+C的含量(49.0%)(表1)。40条Cytb基因序列检出14个变异位点，总变异率为1.23%，其中7个是简约位点，7个是单一位点。没有插入和缺失位点。经分析获得高邮湖大银鱼COⅠ基因序列片段(630 bp)。COⅠ基因序列中碱基组成平均含量为：A(21.6%)、G(19.2%)、C(33.2%)和T(26.0%)，碱基A+T的含量(47.6%)略小于碱基G+C的含量(52.4%)(表1)。40条COⅠ基因序列检出5个多态性位点，总变异率为0.79%，其中4个简约位点，1个单一位点。没有插入和缺失位点。

经PCR扩增、测序和校对，获得高邮湖太湖新银鱼线粒体Cytb基因全长序列(1141 bp)。Cytb基因序列中碱基组成平均含量为：A(21.1%)、G(17.4%)、C(33.5%)和T(28.0%)，碱基A+T的含量(49.1%)略小于碱基G+C的含量(50.9%)(表1)。40条Cytb基因序列检出13个变异位点，总变异率为1.14%，其中4个是简约位点，9个是单一位点。没有插入和缺失位点。经分析获得高邮湖太湖新银鱼COⅠ基因序列片段(630 bp)。COⅠ基因序列中碱基组成平均含量为：A(19.5%)、G(20.8%)、C(34.3%)和T(25.4%)，碱基A+T的含量(44.9%)小于碱基G+C的含量(55.1%)(表1)。40条CO Ⅰ基因序列检出2个变异位点，总变异率为0.32%，均为简约位点。没有插入和缺失位点。

表1 大银鱼和太湖新银鱼Cytb和COⅠ基因序列碱基组成Tab.1 The base composition of Cytb and COⅠgene in icefishP.hyalocranius and N.taihuensis

2.2 大银鱼和太湖新银鱼种群遗传多样性参数

40尾大银鱼定义12个Cytb基因单倍型，分别命名为PHB1～PHB12(GenBank登录号：MK523739～MK523750)，其数量分别为11、1、6、2、2、4、1、2、2、7、1和1，其中PHB1是数量最多的单倍型，占比为27.5%。单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.871±0.031和0.00172±0.00019，平均核苷酸差异数为1.963(表2)；40尾大银鱼定义6个COⅠ基因单倍型，分别命名为PHC1～PHC6(GenBank登录号：MK523751～MK523756)，其数量分别为16、1、8、3、10和2个，其中PHC1是数量最多的单倍型，占比为25.0%。单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.747±0.041和0.00202±0.00019，平均核苷酸差异数为1.272(表2)。

40尾太湖新银鱼定义9个Cytb基因单倍型，分别命名为NTB1～NTB8(GenBank登录号：MK523757～MK523765)，其数量分别为24、1、1、1、2、8、1、1和1个，其中NTB1是数量最多的单倍型，占比为60.0%。单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.609±0.078和0.00094±0.00027，平均核苷酸差异数为1.071(表2)；40尾太湖新银鱼定义3个COⅠ基因单倍型，分别命名为NTC1～NTC3(GenBank登录号：MK523766～MK523768)，其数量分别为35、2和3个，其中NTC1是数量最多的单倍型，占比为87.5%。单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.232±0.085和0.00038±0.00014，平均核苷酸差异数为0.240(表2)。

2.3 大银鱼、太湖新银鱼单倍型系统进化树

高邮湖大银鱼线粒体Cytb和COⅠ基因单倍型间的Kimura双参数遗传距离分别为0.001～0.004和0.002～0.006，相应地，太湖新银鱼2个基因单倍型间的遗传距离分别为0.001～0.006和0.002～0.003。大银鱼和太湖新银鱼Cytb单倍型间的Kimura双参数遗传距离为0.124～0.130，相应地，大银鱼和太湖新银鱼COⅠ单倍型间的遗传距离为0.124～0.130。

采用邻接法和最大似然法构建大银鱼和太湖新银鱼Cytb和COⅠ基因单倍型分子系统进化树(图1、图2)。结果显示，2种方法构建的单倍型系统进化关系基本一致，大银鱼、太湖新银鱼的单倍型各自聚为一支，形成两个独立分支。

2.4 大银鱼、太湖新银鱼群体历史动态

对高邮湖大银鱼、太湖新银鱼进行Tajima′sD和Fu′sFs中性检验(表3)。结果显示，除基于COⅠ基因的大银鱼Tajima′sD中性检验结果为正值外，大银鱼和太湖新银鱼的2种中性检测结果均为负值，且Fu′sFs中性检测结果统计检验达到极显著水平(P<0.01)，说明大银鱼和太湖新银鱼进化过程中显著偏离中性选择。

对高邮湖大银鱼、太湖新银鱼Cytb和COⅠ基因进行核苷酸错配分布分析(图3、图4)。由图3、图4可见，大银鱼、太湖新银鱼Cytb和COⅠ基因序列的核苷酸错配分布图均呈单峰型，结合中性检验结果，可以推断出高邮湖大银鱼、太湖新银鱼群体在历史上经历过种群扩张。

3 讨 论

3.1 高邮湖大银鱼和太湖新银鱼遗传多样性分析

遗传多样性是物种生存适应和发展的前提，也是评价种群资源状况的重要依据，一个物种的遗传多样性水平越高，其进化的潜力及适应环境的能力也越强。反之，物种遗传多样性水平减少可能导致其成活率、生长与繁殖效率变低, 降低种群个体对环境变化的适应能力。衡量一个物种遗传多样性的指标主要是单倍型多样性和核苷酸多样性，单倍型多样性和核苷酸多样性的值越大，说明物种的遗传多样性越丰富[24]。本研究中，基于Cytb和COⅠ基因的高邮湖大银鱼单倍型和核苷酸多样性分别为0.871±0.031、0.00172±0.00019和0.747±0.041、0.00202±0.00019。太湖新银鱼的遗传多样性参数分别为0.609±0.078、0.00094±0.00027和0.232±0.085、0.00038±0.00014。高邮湖大银鱼的遗传多样性明显高于太湖新银鱼遗传多样性，这可能与两种银鱼的有效种群大小有关。近几年的高邮湖渔业资源调查结果显示，大银鱼资源量明显大于太湖新银鱼(未发表)。此外，大银鱼和太湖新银鱼的分布范围、生态位、繁殖力、生长速率等方面的差异导致大银鱼有更强的环境适应能力[1-2]。根据Grant等[25]提出的标准，单倍型多样性和核苷酸多样性高低分别以0.5和0.005为临界值。大银鱼的遗传多样性具有高单倍型多样性和低核苷酸多样性特征；基于Cytb的太湖新银鱼遗传多样性具有较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性特征，而基于COⅠ的太湖新银鱼呈现出极低的单倍型多样性和极低的核苷酸多样性。已有文献报道了我国不同水域大银鱼群体[12,26-29]和太湖新银鱼群体[26,30-31]的遗传多样性水平。通过比较可以得出，高邮湖大银鱼的遗传多样性处于中等水平，而太湖新银鱼的遗传多样性处于较低水平。另外可以看出，基于Cytb的大银鱼和太湖新银鱼的遗传多样性水平高于基于COⅠ的大银鱼和太湖新银鱼的遗传多样性水平，这是因为Cytb基因序列变化速率比COⅠ快，蕴含了更多的遗传信息，与文献报道结果一致[12,32-34]。

表2 大银鱼、太湖新银鱼种群遗传多样性参数Tab.2 Parameters of genetic diversity in populations of icefish P.hyalocranius and N.taihuensis

图1 大银鱼和太湖新银鱼Cytb基因单倍型系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Cytb gene haplotypes of icefish P.hyalocranius and N.taihuensis

图2 大银鱼和太湖新银鱼COⅠ基因单倍型系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of COⅠ gene haplotypes of icefish P.hyalocranius and N.taihuensis

表3大银鱼和太湖新银鱼中性检验结果

Tab.3 The results of neutrality test of icefish P.hyalocranius and N.taihuensis

图3 大银鱼核苷酸错配分布曲线Fig.3 Mismatch distribution of icefish P.hyalocranius

图4 太湖新银鱼核苷酸错配分布曲线Fig.4 Mismatch distribution of icefish N.taihuensis

鱼类的遗传多样性特征与其进化历史密切相关。Grant等[25]提出一个简单模式，利用单倍型多样性和核苷酸多样性来估计种群的进化历史：当单倍型多样性大于等于0.5、核苷酸多样性小于0.05时，是受瓶颈效应后种群数量的迅速扩张导致；当单倍型多样性大于等于0.5、核苷酸多样性大于0.005时，表示种群稳定，具有比较悠久的进化历史；当单倍型多样性小于0.5、核苷酸多样性大于等于0.005时，种群经历了轻微的瓶颈效应，几乎没有影响到核苷酸变异；当单倍型多样性小于0.5、核苷酸多样性小于0.005时，表明种群近期经历了瓶颈效应。本研究结果表明，高邮湖大银鱼遗传多样性具有高单倍型多样性和低核苷酸多样性，属于第一种进化模式。核苷酸多样性积累所需时间比积累单倍型所需的时间长，这说明高邮湖大银鱼是由一个有效种群数量较小的种群，经快速扩张而来，但是仍然没有达到积累核苷酸变异所需要的时间。太湖新银鱼单倍型多样性略高于或明显低于0.5，核苷酸多样性明显低于0.005，整体来看呈现出较低的遗传多样性水平，说明太湖新银鱼种群经历了瓶颈效应，导致遗传多样性水平较低。另外，通过Tajima′sD和Fu′sFs中性检验也可以推断种群进化历史。当Tajima′sD和Fu′sFs呈负值，并且在统计学上有较显著的标准，说明被研究种群经历过一个扩张的历史[35-35]。本研究中高邮湖大银鱼和太湖新银鱼的Tajima′sD和Fu′sFs值为负数，且基于Cytb基因的统计结果具有极显著性。同时，高邮湖大银鱼和太湖新银鱼的核苷酸歧点分布曲线呈单峰型，均说明高邮湖大银鱼和太湖新银鱼在历史上经历过种群扩张。

3.2 高邮湖大银鱼和太湖新银鱼遗传结构差异

研究表明，高邮湖大银鱼Cytb和COⅠ基因序列单倍型间的遗传距离分别为0.001～0.004和0.002～0.006，相应地，太湖新银鱼2个基因单倍型间的遗传距离分别为0.001～0.006和0.002～0.003。由此得出，高邮湖大银鱼、太湖新银鱼种群内单倍型之间的遗传距离非常小，表明两个种群内个体间尚未产生遗传分化。另外，大银鱼和太湖新银鱼的种群遗传结构明显不同：一方面，两个种群的单倍型数量数不同；另一方面，优势单倍型所占比例差异明显，基于Cytb和COⅠ的大银鱼优势单倍型所占比例分别为27.5%和25.0%，相应地，太湖新银鱼优势单倍型所占比例分别为60.0%和87.5%。这种差异导致太湖新银鱼遗传多样性较低，种群结构不稳定，适应环境能力下降。

3.3 高邮湖银鱼资源保护

本研究基于线粒体DNA Cytb和COⅠ基因序列研究了高邮湖大银鱼、太湖新银鱼遗传多样性水平和遗传结构组成。大银鱼的遗传多样性处于中等水平，种群遗传结构较为稳定；太湖新银鱼的遗传多样性处于较低水平，种群遗传结构不稳定。结合银鱼的生物学特点，需要采取多种措施保护高邮湖银鱼资源：控制环境污染，修复和改善银鱼栖息环境；严格控制捕捞强度，减少人类活动干扰；开展人工鱼苗和增殖放流，增加银鱼资源量，优化种群遗传结构，提高遗传多样性水平，增强高邮湖银鱼资源可持续发展能力。