大气压冷等离子体在皮肤病学中的应用

翟思月, 孔刚玉, 夏育民

(1.西安交通大学第二附属医院皮肤病院，陕西 西安 710004；2.西安交通大学等离子体生物医学中心，3.西安交通大学电气工程学院，陕西 西安 710049)

等离子体是由部分电子被剥夺后的气体原子或分子以及这些原子和分子被电离后产生的正负电子组成的离子化气体状物质，是除固体、液体和气体外，物质存在的第四态。等离子体分为两大类:热平衡等离子体和非热平衡等离子体。含有低温度重离子的等离子体被称为大气压冷等离子体(cold atmospheric plasma，CAP)[1]。CAP作为一种新兴的技术，在临床医学中尤其是在皮肤科的应用越来越受到大家的关注。

1 CAP的物理特征及分类

近年，热平衡等离子体不断发展，在医学领域中显示出巨大潜力。但是，患者往往无法耐受因热平衡等离子体使得表皮温度升高所带来的不适；而处于非热平衡的大气压冷等离子体即CAP，却没有这种副作用。CAP治疗生物组织具有可行性，其可保证处理部位皮肤的温度在37～38 ℃之间。这是因为在一个电场中，相比于离子，电子对于周围环境的加热速度更快，从而产生温度为室温或接近室温的等离子体[2]。目前实验室常用的 CAP放电形式主要包括电晕放电、辉光放电、火花放电、介质阻挡放电、滑动弧光放电、微波等离子体及射频等离子体等。CAP发生装置分为三种类型：直接等离子体来源、间接等离子体来源和混合等离子体来源。直接等离子体来源是将人体(如皮肤、内部组织等)作为电极；间接等离子体来源是指这些等离子体在两个电极之间激发产生，等离子体产生的活性成分将作用于目标组织；混合等离子体来源具有前述两种等离子体发生器的优点，其通过比组织电阻更小的接地金属网状电极实现[3],对于医疗应用，目前主要为间接[等离子体射流(atmospheric pressure plasma jet，APPJ)]和直接[介质阻挡放电(dielectric barrier discharges，DBD)]等离子体源。此外，等离子体可以由空气、稀有气体或各种混合气体作为载体气体，经过多种形式激活后，放电产生效应物质[3],这些物质包括正、负电荷离子、自由电子、中性活性氧/氮物种(ROS/RNS)，自由基和分子碎片等多种可相互转化的粒子[4]。等离子体健康应用是近几年逐渐形成的思想模式，是多学科交叉研究的产物，如医学、生物学、物理学、化学以及工程学[5],其研究逐渐趋向白热化阶段[6]。

2 CAP应用的安全性与耐受性

Kos等[7]将APPJ发生器用于小鼠的皮肤创伤模型。结果显示：在一定的处理时间及处理剂量下，CAP治疗安全有效，但是较长时间的CAP治疗会引起直接皮肤损害；当不断增加氦气释放，CAP照射的皮肤表面温度逐渐升高，同时关键性物质“活性氮(RONS)”的含量会增加[7]。

Daeschlein等[8]研究了3种不同来源的等离子体，研究选择健康男性志愿者，予以CAP处理手指部位(3～240秒/次，连续3天)，检测其皮肤湿度。结果发现，所有等离子体治疗均不会损伤皮肤屏障，也不会使得皮肤干燥[8]。 Isbary等[9]在一项前瞻性随机对照研究中，利用CAP治疗24例皮肤慢性感染创面患者，每天治疗2 min，结果发现，无论细菌种类如何，与对照组相比，等离子体处理后的伤口细菌增殖率显著降低(P<0.016)，并且所有患者在治疗过程中均无副作用发生，治疗的耐受性良好[9]。上述研究表明，无论是在动物疾病模型，还是在临床皮肤疾病方面，CAP均可在一定的时间及剂量内达到有效的治疗效果，同时并不会对机体其他的正常组织与结构造成损伤。

大量文献证明，CAP具有促进皮肤伤口愈合与组织再生、抗微生物感染、抑制肿瘤生长等作用，并在非感染性皮肤病等治疗上展示良好效应[2,6]。

3 CAP抑制皮肤伤口的微生物感染

CAP能够抑制物体表面的微生物感染，包括非生命体表面、生物膜以及被污染或感染组织内细菌及真菌的生长[2]。Maisch等[10]研究了CAP对于革兰氏阳性菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感菌)以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的抑制性作用。该研究在6月龄母猪的皮肤表面种植细菌，然后给予CAP处理。结果显示，对于金黄色葡萄球菌及大肠杆菌，CAP治疗6 min的灭菌率即达99.9%；对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，CAP处理4 min的有效率达到99.9%。对照组与CAP处理组(24 h)比较，组织与细胞未出现形态学改变，没有明显细胞坏死及凋亡。可见，CAP不仅能够抑制普通细菌的感染，同时对具有广谱耐药性的耐甲氧西林菌也能够在数分钟内灭活，并且有效率高达99.9%，这为今后利用CAP治疗由人体皮肤耐药菌感染引起的皮肤病提供了可能性。

Mai-Prochnow等[11]认为，CAP所产生的包含有活性氧及活性氮的成分会直接作用于细胞的细胞壁或者细胞膜：活性氧触发了细胞脂质过氧化反应，引起Fe-S依赖的脱水酶失活，单核细胞铁蛋白破坏以及DNA损伤，进而引起细胞的失活。Dezest等[12]使用不同组分的载体气体(氦气、含有1%氧气或氮气的氦气)，研究了CAP对于培养皿中大肠杆菌的抑制作用。结果显示，CAP引起大肠杆菌的死亡，作用机制一方面可能是CAP引起细菌结构发生改变(细胞膜缺乏及细胞形态学变化)，另一方面可能是氧化应激反应使得大肠杆菌细胞相关蛋白在脂质过氧化反应及硝基化作用下，发生了羰基化反应，从而使得大肠杆菌细胞失活，这种抑制效果尤以氧气作为载体的CAP为著；另外，该研究还发现活性氧及活性氮并非是引起大肠杆菌死亡的唯一因素，电场及带电离子也起着非常重要的作用。因此CAP抑制大肠杆菌增殖不仅与等离子体源的载体气体成分有关，还与氧化活性物质的相互转化有关[13]。

Heinlin等[14]研究了CAP对皮肤红色毛癣菌及犬小孢子菌的作用。从患者头癣及足癣皮损上提取真菌，接种于培养基上，给予不同持续时间及间隔时间的CAP治疗，对照组给予短波灭菌紫外线照射治疗。结果显示，CAP处理(每日10 min，连续9天)可抑制真菌生长而对照组仍有真菌生长。Maisch等[15]检测了CAP对于白色念珠菌的作用，发现CAP对白色念珠菌有很强的灭活作用。

Brun等[16]研究了CAP对于人类皮肤疱疹病毒1型(hHSV-1)与甲型肝炎病毒(HAV)的作用[2]。该研究以氦气等离子体发生装置对被hHSV-1感染的细胞进行5 min照射，结果发现被hHSV-1感染的细胞与对照组发生了相同的细胞病理性改变；但甲型肝炎病毒对CAP显示出了更高的敏感性。Brun等认为，HAV与hHSV-1的最大区别就是，HAV缺乏病毒包膜，而Hhsv-1作为双链DNA病毒具有包膜。这样看来，CAP能否对病毒感染的细胞产生破坏作用，可能与病毒是否有包膜相关。

大量研究证明，CAP抑制微生物感染可能有3种机制：①微生物细胞膜或者细胞壁的渗透性改变使得合成蛋白质的原料无法进入细胞；②活性氧及活性氮的作用导致胞内蛋白质被破坏；③CAP直接破坏细菌的DNA[11，17]。CAP抑制物体表面细菌感染主要是通过氧化活性物质如ROS、RON等的毒性作用；此外，CAP抑制细菌感染还可能与CAP发生装置的载体气体有关，例如上述实验证明，在探究CAP对大肠杆菌的抑制效果时，以氧气为载体气体的治疗有效率要高于以氮气及氦气为载体气体的治疗有效率[12];但是，CAP对于细菌的治疗效果评估还需根据CAP的作用时间与作用剂量以及其所治疗的疾病种类综合考虑。大量文献表明，病毒感染涉及非常复杂的机制，包括细胞内及细胞外的多种信号通路，CAP抑制病毒感染的机制可能与病毒的特殊结构“包膜”有关，即CAP更有利于无包膜病毒的抑制；然而，CAP对于真菌的灭活机制，目前还没有统一的定论。

4 CAP促使伤口愈合

Hasse等[18]研究了CAP对于皮肤伤口的影响。该研究从正常人体皮肤上切取直径为5 mm的组织，予以CAP照射。结果发现，CAP照射1或3 min，细胞不断增殖，促使表皮修复，有利于伤口的愈合；CAP照射3～5 min后，可以观察到部分细胞凋亡。Arndt等[19]研究了CAP影响角质形成细胞基因表达的作用。该研究采用MicroPlaster-β产生CAP，并处理伤口。结果发现，CAP会促使编码白介素(IL)-8、转化生长因子(TGF)-β1、TGF-β2的基因表达；体内外实验均显示，在伤口愈合过程中，角质形成细胞的增殖、迁移及凋亡过程并未受明显影响。正如上述实验所述，CAP促使伤口愈合具有时间依赖性，在一定时间及剂量内CAP可在不影响角质细胞活性的前提下，促使编码与伤口愈合相关的细胞因子的表达，从而达到促使伤口愈合的目的。

5 CAP抑制肿瘤的增殖及迁移

Binenbaum等[20]设计了一种手持CAP发生装置(电压小于1 200 V)，研究其对黑色素瘤的作用。体内外实验皆显示，CAP可以抑制黑色素瘤的发展。头颈部鳞状细胞癌是皮肤常见肿瘤，尽管已有单克隆抗体疗法，但是这类肿瘤的治疗方法仍有局限。Welz等[21]研究了CAP对于头颈部鳞状细胞癌的抑制作用,发现 CAP照射(30～180 s)明显抑制癌细胞活性，剂量依赖性的DNA破坏可能是CAP抑制肿瘤活性的关键机制。

Gumbel等[22]证明，CAP会抑制骨肉瘤细胞增殖，细胞内p53 蛋白及其磷酸化增强，还有细胞核的特征性改变。Gay-Mimbrera等[3]认为，细胞内ROS及RNS的含量受到抗氧化物质以及清除酶的精细调控，RNS参与了许多生物学活动，例如巨噬细胞功能及含氮氧化物调节血管舒张作用等。然而当ROS、RNS含量超过体内氧化还原反应控制系统的平衡能力时，氧化应激反应就会发生，其后果是对细胞产生毒性，引起细胞死亡。正常细胞与肿瘤细胞的细胞周期不同，引起各自对氧化应激敏感性不同。因此在不破坏正常细胞情况下，CAP通过调节细胞内RNS，选择性攻击肿瘤细胞，最终引起后者严重破坏甚至死亡。

可见，因肿瘤细胞对于氧化应激敏感性更高，CAP可通过氧化活性物质如ROS、RNS等物质破坏肿瘤细胞DNA，同时增强p53基因的表达与磷酸化，进而使得p53蛋白抑制肿瘤发生、发展的作用增强，最终抑制肿瘤细胞的增殖甚至引起肿瘤细胞死亡。

6 CAP治疗银屑病

Gan等[23]使用APPJ直接处理小鼠银屑病样皮炎，同时用APPJ处理过的细胞培养基培养HaCaT角质细胞，结果表明，经CAP治疗的小鼠银屑病样皮损较对照组有明显好转，并且对小鼠皮肤的其他结构未见任何损害；经APPJ处理过的培养基角质细胞内ROS增加，引起角化细胞凋亡。

大量文献表明，IL-12可导致T淋巴细胞异常活化，引起非感染性炎症反应如角质形成细胞异常增殖，从而参与银屑病发病。Zhong等[24]对CAP治疗银屑病进行了基础研究,采用DBD激发产生的CAP对人角质形成细胞进行处理。结果发现：CAP处理2 min，细胞存活能力基本正常，仅有少许细胞凋亡；CAP处理3 min，细胞膜有气泡产生同时有部分细胞从培养皿上脱落，细胞存活能力明显降低，凋亡细胞比例增多；继续将时间增至4 min，发现有细胞坏死与凝固，细胞活性大幅降低，大量细胞凋亡。CAP照射后，细胞表达IL-6、IL-8、血管内皮生长因子明显增加，而IL-12表达水平明显降低。表明CAP促使角质形成细胞凋亡及相关细胞因子的释放，同时IL-12表达减少，有助于缓解T淋巴细胞浸润、炎症反应及角质形成细胞增殖，导致银屑病皮损损害减轻。上述实验证明，无论是直接还是间接等离子体源所产生的CAP对于银屑病的发生与发展均有抑制作用，同时印证CAP产生的ROS会促使角质形成细胞的死亡，可能的机制主要与CAP抑制T淋巴细胞的浸润及相关炎症因子的异常活化与释放有关。

7 结语

CAP在皮肤病中的应用越来越受到人们的关注。在保证CAP的安全性及可耐受性的前提下，CAP具有抗细菌、病毒、真菌感染作用，能够促进皮肤伤口愈合，抑制肿瘤细胞增殖及迁移，同时对银屑病、瘙痒症也有望产生疗效。虽然已知ROS、RONS及多种细胞因子参与CAP的治疗作用，但是这些因素具体如何相互作用及联系，均待进一步研究证明。在其应用中应充分考虑提高疗效并避免可能的副作用。随着相关技术不断发展，将来对CAP会有更为系统、全面的认识，这势必会给皮肤病学带来不可估量的价值。