微量稀释法检测淋球菌流行株药敏试验结果分析

伍福恒, 林珠玲, 陈立新, 林雯清

(江门市新会区皮肤医院检验科，广东 江门 529100)

淋病是一种由淋球菌感染引起的性传播疾病，是我国法定的乙类传染病。监控数据显示，近年我国淋病发病率呈现上升趋势[1]。近年来，随着抗生素的滥用和淋球菌耐药质粒的传播，淋球菌对多种抗生素呈现耐药性[2]。为了解本院淋球菌耐药情况，我院于2016年10月至2018年6月期间对所收集的淋球菌流行株进行耐药性监测，并对质粒介导的产β-内酰胺酶淋球菌(penicillinase producingNeisseriagonorrhoeae,PPNG)和四环素高度耐药淋球菌(tetracycline-resistantNeisseriagonorrhoeae,TRNG)进行检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

临床菌株：收集2016年10月至2018年6月从我院性病门诊患者泌尿生殖道中分离的淋球菌流行株，共95株。男性患者于尿道口内2～4 cm处取材，女性患者于宫颈口1～2 cm处取材，所有标本均接种于淋球菌选择培养基(TM)和血琼脂培养基，放于35 ℃ CO2培养箱中，培养24小时。菌株培养、分纯后，经革兰染色、氧化酶、糖发酵试验鉴定为淋球菌后,挑取菌落溶于小牛血清冻存管中，置于-70 ℃低温冰箱保存备用。

质控菌株：淋球菌质控菌株D、G、J、L株由广东省皮肤性病防治中心提供。

1.2 抗生素和培养基

采用微量稀释法对淋球菌进行耐药性检测，测定其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)[3]。青霉素、四环素、环丙沙星、大观霉素、头孢曲松、头孢克肟和阿奇霉素等7种抗生素按倍比稀释后加于96孔测试板内，形成7种抗生素不同浓度梯度。青霉素、四环素和环丙沙星检测浓度均为0.015～32.000 μg/mL，大观霉素检测浓度为0.060～128.000 μg/mL，头孢曲松和头孢克肟检测浓度为0.0005～1.000 μg/mL，阿奇霉素检测浓度为0.004～8.000 μg/mL。药敏测试板、MH肉汤、无菌生理盐水均由广东省皮肤性病防治中心提供。淋球菌选择培养基和血琼脂培养基购于江门凯林贸易有限公司。

1.3 方法

MIC测定：将复苏后的淋球菌转种，经2-3代纯化培养后溶于无菌生理盐水，配制成0.5麦氏浓度单位菌悬液，吸取150 μL菌悬液加于MH肉汤培养基中混匀，将混匀液分别加于含有不同浓度梯度抗生素的测试板内(每孔100 μL)，放于35 ℃ 5%～10% CO2培养箱中，24小时后读取结果。结果判读标准参考WHO西太区淋球菌耐药监测规划推荐标准[4]。每次实验均设立阴性和阳性对照。

PPNG和TRNG测定：PPNG测定采用纸片酸度法[5]，每次实验均用标准株作阴性和阳性对照。TRNG测定以四环素MIC≥16 μg/mL为阳性判断标准[4]。

2 结果

2.1 淋球菌耐药性监测结果

青霉素、四环素和环丙沙星的MIC50分别为2.000、8.000、4.000 μg/mL，均已超过耐药标准(≥1 μg/mL);阿奇霉素的MIC50为0.250 μg/mL，MIC90为1.000 μg/mL，落在耐药折点(≥1 μg/mL);头孢曲松和头孢克肟的MIC50、MIC90分别为0.015、0.060 μg/mL和0.030、0.125 μg/mL，均在敏感范围(≤0.125 μg/mL和≤0.250 μg/mL)。 95株淋球菌流行株中未发现对青霉素和环丙沙星敏感菌株；大观霉素、头孢曲松、头孢克肟敏感性均为100%，未发现耐药菌株，其中头孢曲松和头孢克肟敏感性下降菌株(低敏)分离率为5.26%和9.47%；阿奇霉素的耐药率为 14.74%。详见表1、2。

注：1)为敏感性下降菌株，即低敏菌株。

2.2 PPNG和TRNG检测结果

95株淋球菌流行株中检出PPNG阳性菌株32株，阳性率为33.68%;检出TRNG阳性菌株35株，阳性率为36.84%。

3 讨论

淋球菌的耐药性越来越严重，引起了全世界的重视。WHO西太区淋球菌耐药性检测规划协作小组建议使用琼脂稀释法检测MIC，该法操作繁琐，且只能作回顾性监测和批量检测，不能及时发现对头孢曲松耐药的“超级淋球菌”。Wu等[3]报道采用微量稀释法和琼脂稀释法进行了淋球菌药敏试验的方法学比较，两者的基本符合率为96%以上，药敏符合率95%～100%，重大误差和极重大误差分别为0～3%和0，表明微量稀释法和琼脂稀释法对淋球菌的药物敏感性试验具有良好的一致性。微量稀释法能实时对单个菌株进行耐药性检测，提高检测时效性，可协助临床及时有效地发现耐药菌株。此外，该方法还具有操作简单、结果判读容易、无需特殊仪器等优点，适合基层单位实时检测淋球菌的MIC，故本次检测采用微量稀释法进行。

本次共检测淋球菌流行株95株，检测结果显示淋球菌对青霉素、四环素的耐药率分别为75.79%、86.32%，与梁佩婵等[6]报道结果基本一致。根据WHO规定，当某种抗菌药物的耐药率高于5%时，该药不应作为首选药物，当耐药率高于10%时，应当停止使用。因此，青霉素、四环素已不适宜作为治疗淋病使用药物。95株淋球菌流行株中，质粒介导的PPNG阳性率为33.68%，TRNG阳性率为36.84%，提示本地区已成为PPNG和TRNG高流行区域，这与本市2010-2016年检测数据相近[6-7]。本地区PPNG、TRNG流行率均高于珠海地区[8]，这可能与淋球菌耐药性具有区域特征性有关。

环丙沙星作为氟喹诺酮类抗生素,曾是治疗淋病的首选药物，随着氟喹诺酮类药物的广泛使用，淋球菌对其的耐药性持续增高，到20世纪90年代末期，该药治疗淋病失败率高达90%以上[9]。本次实验结果显示，95株淋球菌流行株对环丙沙星耐药率为91.58%，与国内大部分检测数据基本一致[2,8-9]，提示环丙沙星已不能用于淋病的治疗。

本次检测结果中未发现对大观霉素、头孢曲松、头孢克肟耐药菌株，此三种抗生素仍可作为治疗淋病的首选药物。但头孢曲松和头孢克肟低敏率分别为5.26%(5/95)和9.47%(9/95)，与本市2013-2014年检测数据[6]相比，低敏菌株检出率呈现增高趋势，和李明等[10]的报道相近，与全国流行趋势相符[11]。淋球菌对头孢类药物敏感度降低，将会导致淋病的治疗愈加困难，据相关文献报道[12-13]，部分地区已出现大观霉素、头孢曲松耐药菌株。因此，密切监测淋球菌对大观霉素、头孢曲松、头孢克肟耐药性发展趋势，以及采用微量稀释法实时检测淋球菌的药物敏感性,有助于及时发现耐药菌株，指导临床合理用药。

阿奇霉素是大环内酯类抗生素，对淋球菌和衣原体感染具有较好疗效。21世纪初期，国内推荐阿奇霉素作为治疗淋球菌的首选药物。近年来，淋球菌对阿奇霉素耐药性持续增高，阿奇霉素已不适宜作为治疗淋病的一线药物。本次检测显示淋球菌对阿奇霉素耐药率为14.74%，与嘉兴[2]、广州[9]、东莞[10]等地区报道相近，远低于上海地区[14]。阿奇霉素是对头孢菌素和青霉素过敏的淋病患者选用药物之一，应根据药敏结果选择性使用阿奇霉素治疗淋病，并加强阿奇霉素的耐药性监测及其耐药机制的研究，防止阿奇霉素普遍耐药的发生。

综上所述，青霉素、四环素、环丙沙星耐药率高，已不适宜作为治疗淋病的选用药物。大观霉素、头孢曲松、头孢克肟耐药率低，仍可作为治疗淋病的一线用药。阿奇霉素对淋球菌存在一定程度耐药，应根据药敏结果谨慎选用。采用微量稀释法持续监测淋球菌耐药性，有助于及时发现耐药菌株，为科学制定治疗措施提供依据。