巨噬细胞极化与骨组织再生关系的研究进展

梁蓓蕾， 王佐林

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院·同济大学附属口腔医院种植科，上海 200072）

肿瘤切除、牙周炎等引起的骨缺损，通常需要使用骨生物材料进行手术治疗[1]。 作为异物，植入物被免疫系统识别并引发显著的免疫反应，继而影响成骨细胞的生物学行为。 在这一背景下，骨生物材料的设计范例已从相对惰性转变为主动免疫调节[2]。 巨噬细胞作为第1 批到达的免疫细胞，其随局部环境产生不同功能表型的能力，使骨生物材料的免疫调节功能成为可能，因而在骨组织再生领域备受关注[3]。

1 巨噬细胞及其极化

巨噬细胞（macrophage）因其吞噬效应消除有害病原体的保护作用而闻名[4]。 过去公认的巨噬细胞主要来源于髓系单核细胞，通过响应受损组织或与病原体相关信号经循环系统进入组织发挥免疫作用。 但近年来的研究发现，早在胚胎发育过程中即已产生一些组织驻留的巨噬细胞， 在损伤期间，通过快速增殖维持其局部群体， 共同参与组织修复、免疫监视和体内稳态的维持[5]。

巨噬细胞极化是巨噬细胞响应局部微环境中的信号， 分化为具有不同功能表型频谱细胞的过程[6]。 早在20 世纪90 年代初期，干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导活化的巨噬细胞已被定义为经典活化型巨噬细胞，它们通过分泌大量炎性细胞因子[如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）]及趋化因子（如CC 趋化因子配体2）参与炎症反应及杀菌过程[7]。 而随后的研究发现，IL-4 诱导活化的巨噬细胞的吞噬和杀伤效应明显下降，转而通过分泌抗炎因子（如IL-10），生长因子[如转化生长因子-β（transforming growth factorβ， TGF-β）， 血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）]等发挥抗炎作用，并通过调节细胞外基质沉积、 血管生成等参与组织修复过程。为表示区分，此类巨噬细胞被定义为“替代活化型巨噬细胞”[8]。

随后镜像“Th1/Th2”细胞命名法，“M1/M2”二分法被提出以分别对应此前提出的经典/替代活化型巨噬细胞的定义，M0 则被用以标记未活化巨噬细胞亚型。 第3 代的定义将M2 型巨噬细胞进一步区分为M2a、M2b 和M2c 3 种亚群[9]。 M2a 表型响应IL-4 和IL-13，以增加表面标志物CD206、精氨酸酶和TGF-β 的表达为特征；M2b 表型暴露于IgG 免疫复合物和IL-1β， 增加IL-10 的产生并降低IL-12；M2c 表型则在IL-10、TGF-β 或糖皮质激素刺激作用下产生， 其特征是高表达IL-10 和表面受体CD163。但是，巨噬细胞的极化类型可随时通过局部微环境的变化发生相互转化。 巨噬细胞极化应该被视为一个具有系列表型的平衡谱，而不是简单理解为划分为群的状态[7]。 由于表达标记的重叠，目前最常使用的依然是“M1/M2 型”或“M1/M2 样”分类方法[4]。

2 骨组织再生的过程

当骨组织受到损伤时，血管破裂，血小板被激活，多种凝血因子、细胞因子及趋化因子释放，引发止血效应， 多种类型细胞受募集迁移至损伤部位，促成骨组织修复的初始阶段[9]。 生物材料作为异物，一旦被植入，材料表面将吸附血浆蛋白以形成蛋白吸附层，从而启动血小板和其他血液凝固因子诱导的先天性免疫反应，骨再生开始[10]。

中性粒细胞首先到达损伤部位， 并提供信号分子，募集巨噬细胞到达损伤部位[11]。其后，巨噬细胞开始占据主导地位[9]，通过分泌细胞因子和趋化因子，进一步募集白细胞。 此外，巨噬细胞能够去除凋亡的中性粒细胞， 其吞噬作用可能导致更多M1 型巨噬细胞向M2 型巨噬细胞改变和炎症期的消退[3]。其他免疫细胞， 也通过局部分泌参与伤口愈合的早期阶段，并影响单核/巨噬细胞的极化与破骨分化[11]。

随后的增殖期涉及细胞增殖、血管生成、胶原沉积[12]。 该期间巨噬细胞的参与和极化可能对随后的重塑阶段产生显著影响。 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 增殖及胶原蛋白沉积所需的一些支持性生长因子，包括TGF-β 及骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）等均可由巨噬细胞分泌[1]。

在沉积大量胶原后，重塑阶段开始。 软的愈伤组织矿化并转化为具有不规则排列的（编织）骨的骨愈伤组织，并伴有新生血管侵入[9]。 随后编织骨重塑为正常的层状骨，这依赖于成骨细胞和破骨细胞功能的平衡[13]。 巨噬细胞作为破骨细胞同源细胞或前体细胞[14]，似乎能够参与协调骨代谢平衡。

3 巨噬细胞及其极化与骨组织修复的关系

如上所述，巨噬细胞是骨组织再生过程中的关键介质。 首先，巨噬细胞能够通过吞噬作用清除侵入的生物体、受损的细胞碎片及凋亡的中性粒细胞等；其次，巨噬细胞响应组织微环境的变化而大量增殖并经历显著的表型及功能改变，成为各类细胞外基质成分和促组织修复再生的可溶性介质的有效来源[2]；再次，巨噬细胞还可通过调节参与骨愈合过程的细胞（如MSCs）在组织再生中发挥关键作用[5]，并能激活环境中的其他细胞以表达更多对骨构建有益但不主要由其产生的细胞因子，各种细胞类型之间串扰为骨再生的动态调节提供了基础[14]。

多项动物实验进一步证实了巨噬细胞的重要性。 骨损伤修复过程中的巨噬细胞耗竭导致骨愈合受损，巨噬细胞缺陷动物的愈伤组织较小，骨含量较少[3]。此外，巨噬细胞的重要性还具有一定的时间效应。 软骨内骨折愈合的小鼠若在炎症早期耗竭巨噬细胞，软骨性软愈伤组织的形成被完全消除，而在后期耗竭巨噬细胞则导致愈伤组织变小，愈伤组织的大小与愈伤组织中剩余巨噬细胞的数量成正比[15]。需要关注的是，巨噬细胞被“激活”可获得一系列表型，各极化亚型在骨组织再生过程中的作用也成为了研究的热点课题。

3.1 M0 巨噬细胞对骨组织再生的影响

Chang 等[16]关注了原代成骨细胞培养物的异质性，发现从小鼠颅骨分离的原始成骨细胞培养物中含有11%～17%的F4/80 +巨噬细胞。 从原代培养物中耗尽巨噬细胞时，矿化和成骨细胞分化基因的表达显著降低。Nicolaidou 等[17]发现单核细胞产生的抑瘤素M（oncostatin-M，OSM）能增强人MSCs 成骨分化。 然而也有学者认为分泌在巨噬细胞上清液中的IL-1β、TNF-α 等细胞因子对成骨分化起抑制作用[18]。

3.2 M1 巨噬细胞对骨组织再生的影响

传统观点认为，经典活化的炎性巨噬细胞（M1）分泌大量炎性细胞因子， 上调核因子κB 受体活化因 子 配 体 （receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），增强破骨细胞的分化和吸收，导致骨量表达降低[19]。然而，高硕等[20]发现LPS 存在的炎性条件下， 巨噬细胞能增强MSCs 的迁移能力。 此外， 在Transwell 系统中，LPS 活化的巨噬细胞共培养的小鼠成骨细胞，显示出更明显的钙化[14]。

3.3 M2 巨噬细胞对骨组织再生的影响

Gong 等[21]发现与M2 巨噬细胞共培养的MSCs中ALP 活性及骨矿化增加， 成骨相关基因上调，这些结果可能是由M2 巨噬细胞产生的促再生细胞因子（如TGF-β、血管内皮生长因子等）介导的。 Zhang等[22]发现，各型巨噬细胞均以不同方式影响骨髓间充质干细胞的成骨分化，M0 和M1 巨噬细胞部分增强了早期和中期的成骨效应，但未促进细胞外基质矿化；而与M2 巨噬细胞直接或间接共培养的MSCs获得更明显的基质矿化。

综上所述， 在不同实验室的特定共培养条件下，所有巨噬细胞亚型对骨再生的作用似乎是一个有趣而矛盾的结果。 但Spiller 等[23]的研究可能带来新的思路，该研究认为在血管网发芽、吻合和成熟过程中，M1 巨噬细胞分泌引发血管生成过程的因子（如血管内皮生长因子）；M2a 巨噬细胞促进血管融合， 并可能通过PDGF-BB 的分泌募集周细胞；M2c 巨噬细胞则促进内皮细胞体外发芽，并分泌高水平的MMP9 在血管重构中发挥重要作用。 这项研究的结果显示了巨噬细胞控制血管生成的复杂性。同样， 骨组织再生过程也是一个复杂的机体反应，在此过程中，各型巨噬细胞可能也需要不同阶段协同作用才能得到最终的重塑骨组织。

4 通过调节巨噬细胞极化促进骨组织再生

基于巨噬细胞的功能可塑性及其与骨组织再生的串扰，通过靶向巨噬细胞来促进骨组织再生的生物材料备受关注，其策略主要分为2 种。 一种是调节骨缺损部位巨噬细胞的数量。 Raggatt 等[15]提出，通过增加骨折部位巨噬细胞数量的方法可以增强骨再生。 这些研究表明，损伤时局部注射巨噬细胞集落刺激因子（monocyte colony-stimulating factor，M-CSF）可显著增加骨折部位巨噬细胞的数量，从而改善膜内骨和软骨内骨的形成。 另一种是通过改变骨修复材料的理化性质和生物材料释放的离子和可溶性因子等， 调节局部巨噬细胞极化以支持骨再生。天然的光滑钛会引起急性炎症和M1 极化，而经硅烷化处理的钛的炎症性则明显降低，并能通过适度参与NF-κB 信号传导途径促进巨噬细胞M2 极化[24]。 含锶生物活性玻璃微球（strontium-contained bioactive glasses microspheres， SrBGM）可通过将M1转化为M2 来调节巨噬细胞表型， 并表达高水平的PDGF-BB，有助于早期血管生成，并促进体内新骨形成[25]。 Chen 等[26]制备了二氧化钛纳米管上的双水凝胶层系统作为储库， 通过IFN-γ 和IL-4 的顺序作用来调节从M1 到M2 的巨噬细胞表型转换，分子的顺序释放受自然愈合过程的启发， 满足顺序释放策略要求的材料的开发有望显著提高组织工程中免疫调节的技术水平。

综上所述，巨噬细胞及其响应局部微环境所获得独特的功能表型在骨组织再生过程中具有重要意义，通过调节巨噬细胞改变骨再生相关细胞命运和行为的有效性已得到很好的证实。 但对于特定线索对巨噬细胞行为及其后续功能影响的细节的理解尚不完整， 一些实验数据尚不确定或相互矛盾，这就使基于此设计的组织工程材料的临床转化受到限制。 因此，充分了解巨噬细胞及其极化在骨组织再生过程中的细节（如各极化类型出现的时期、比例状态、功能作用等），并在此基础上更加有效地选择巨噬细胞极化的时间点及方式，将会成为未来实现更好的组织工程材料开发及临床转化的重要研究方向。