KLFs与肿瘤干细胞相关性的研究进展

王家雄，朱慧勇

目前手术和(或)放化疗仍然是治疗恶性肿瘤的主要方法，然而尽管各种手术及辅助放化疗的方案在不断优化，并且改善了患者的生活质量，但对于长期存活率并没有显著提高[1-3]。有临床研究表明，目前应用的化疗试剂如5-氟尿嘧啶能杀伤肿瘤中的分化细胞，但肿瘤中存在一些具有分化潜能的干细胞样细胞，对此的反应较差，治疗后反而使这些细胞富集，导致肿瘤复发，且新生肿物与原发肿瘤有近似的遗传学改变[4]。推测术后新生肿瘤可能与这些具有增殖分化潜能的细胞团块有密切联系。目前对一些新辅助治疗方法的探索已经兴起，比如肿瘤干细胞理论。该理论对肿瘤复发及转移等行为提出了较为合理的解释，提供了新的治疗方向[5-6]。近年来有研究发现Krüppel样转录因子(Krüppel-like factors，KLFs)家族可能与肿瘤的发生、发展、转移相关，而肿瘤干细胞可能在KLFs与肿瘤行为的联系中起重要作用。

1 肿瘤干细胞与肿瘤的关系

1.1 肿瘤干细胞

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)指肿瘤中具有无限增殖能力及分化出异质肿瘤细胞能力的细胞。肿瘤干细胞理论认为，肿瘤细胞中存在一个特定的具有干细胞样特征的细胞亚群，即“肿瘤干细胞”，或称“肿瘤干细胞样细胞”，其与肿瘤的发生、发展、转移、复发密切相关。这些细胞类似正常的组织干细胞，具有自我更新与分化潜力，能形成不同的肿瘤细胞类型，从而导致肿瘤的异质性。同时，肿瘤内其他细胞不具有无限增殖能力，不能分化出所有类型的肿瘤细胞。肿瘤侧群细胞(Side Population cells，SP cells)也可认为是肿瘤干细胞样细胞。Ojha等[7]通过对膀胱癌SP细胞及非SP细胞，膀胱癌细胞系T24及UM-UC-3的研究，发现SP细胞相对于其他细胞高表达Sox-2、Nanog、KLF-4、Oct-4、ABCG2、MDR1，并且具有更强的成球能力，且SP细胞能增殖出非SP细胞，表明SP细胞同样具有干性。

Bánkfalvi等[8-9]对口腔癌组织的组织型、表现型及染色体组型做了研究分析，实验发现了口腔癌的细胞异质性，其中存在着不同表型及分化程度的肿瘤细胞。这些细胞的增殖活性和克隆形成能力具有很大差异，Mackenzie等通过对不同口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)细胞系的培养研究发现形成的恶性细胞团块来自于一小部分细胞，即其中只有一小部分细胞具有克隆形成能力。Chiou等[10]通过对OSCC细胞系以及OSCC原代细胞进行无血清成球培养，成功富集了干细胞样细胞，其能高表达Oct-4、Nanog、CD117、Nestin、CD133等细胞干性标记物，表明口腔癌中确实存在肿瘤干细胞样细胞。

此外，在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤组织中也均发现有肿瘤干细胞样细胞的存在[11-14]。

1.2 肿瘤干细胞与恶性肿瘤转移的关系

大部分的癌症死亡是由于转移引起的，肿瘤细胞从原发肿瘤中逃逸，通过淋巴与血管系统在远处器官存活下来，进而形成继发肿瘤。而其中只有极少数肿瘤细胞能够逃过人体的免疫系统而幸存[15]。研究发现，每克肿瘤组织每天能释放多达1×106个肿瘤细胞进入血液循环，但肿瘤的远端转移却没有这么多[16]。这说明肿瘤中仅极小部分细胞能成功地远端转移。但这种特性在涉及到非肿瘤干细胞至肿瘤干细胞的转化潜能时，尚需更多的实验证据支持。但通过一些特定的标志物，如CD26、CXCR4及CD44等能够检测出这些具有转移能力的肿瘤细胞亚群[17-19]。

Lawson等[20]构建了基于人乳腺癌细胞的转移模型，发现早期转移细胞具有明显的干细胞样基因表达特征，而与之相反的，晚期转移细胞的基因特征与原发肿瘤的基因特征更为接近，分化标记物的表达增加，干细胞样特征则减少。这些实验结果表明转移由干细胞样细胞启动，这些细胞增殖和分化引起肿瘤的转移。

1.3 肿瘤干细胞与肿瘤抗性

近50年来，外科手术与放化疗一直是治疗癌症较为有效的方法。然而，尽管治疗方案在不断改进，大部分患者仍然存在着肿瘤的复发与耐药现象。大量的细胞实验、动物实验及临床研究表明，肿瘤干细胞可能是癌症复发与耐药性的罪魁祸首[21-23]。肿瘤干细胞大多处于休眠状态，而当前化疗试剂如顺铂、5-氟脲嘧啶等多指向分裂期的细胞，这也使肿瘤干细胞与肿瘤细胞对化疗的敏感性存在差异。Colak等[24]报道，结肠癌干细胞能选择性地抵抗由化疗介导的细胞凋亡，而已分化结肠癌细胞则对化疗相对敏感。且存活的肿瘤干细胞还能重启增殖，证明了肿瘤干细胞与肿瘤治疗的耐药性相关。而Ojha等对膀胱癌SP细胞的研究，发现SP细胞表现出较低的活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平及较高的谷胱甘肽比率(GSH/GSSG)，这可能与肿瘤的放射抗性相关[7]。此外放化疗也会导致普通肿瘤细胞转化为诱导肿瘤干细胞(induced cancer stem cells，iCSCs)，从而导致肿瘤的复发与转移[6，25]。

2 KLFs与肿瘤干细胞的关系

KLFs是一类广泛分布于哺乳动物细胞内的包含锌指结构的转录因子，其通过3个C2H2型锌指结构与DNA富GC区域结合，这种结构在该组转录因子中高度保守，与首批被鉴别的哺乳动物转录因子SP1具有同源性，因此又被归类为KLFs/SP家族(Krüppel-like factors/ specificity protein，KLFs/SP)[26]。目前研究已发现17种KLF因子，分别命名为KLF1～KLF17，其功能与人类各大系统生理过程及疾病发生密切相关[27-31]。它们在调节细胞增殖、分化、发育、凋亡甚至肿瘤的发生、发展与转移等方面起到重要的作用。例如KLF-4能够通过影响致癌基因K-ras的表达抑制肿瘤细胞的生长[32]。还可通过下调组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1/TIMP-2，以及E-cadherin和上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白如Snail等来抑制肝细胞癌细胞的侵袭性[33]。KLF-17也能够抑制肿瘤的转移[34]。而KLF6-SV1和KLF-8的高表达则会促进肿瘤的发生与转移[35-36]。

KLFs对于肿瘤发生、发展及转移等行为的调控可能与肿瘤干细胞有关。其在肿瘤干细胞干性的建立或维持中起重要作用[37]。而KLFs对肿瘤干细胞干性的影响则可能是通过调节细胞周期实现。CDKs家族是重要的细胞周期相关蛋白，KLFs尤其是KLF-4与KLF-5会影响编码细胞周期蛋白相关基因的转录，Yang等对食管癌细胞系的研究发现在细胞接受紫外线照射损伤DNA后，KLF-4与KLF-5可上调CDK抑制剂p21的表达，且进一步研究发现KLF-4可能优先激活DNA修复通路，而KLF-5则在紫外线照射后诱导DNA修复和凋亡[38]。

此外，Wnt/β-catenin通路在肿瘤行为中也起到了重要的作用。Wnt/β-catenin通路是细胞因子调节肿瘤细胞增殖的重要通路，是KLFs的共同靶点。比如KLF-4通过拮抗TCF-4与β-catenin的结合从而抑制Wnt通路[39-40]，KLF-6同样抑制Wnt通路[41]，而相反的，KLF-5与KLF-8则会增强Wnt通路[42-43]。

TGF-β也是肿瘤细胞增殖的重要通路。KLF-10的过表达可增加内源性TGF-β调控基因p21与PAI-1的表达[44]，KLF-5在存在TGF-β情况下会抑制癌基因Myc的表达，而缺乏TGF-β的情况下则相反[45]。

目前对于肿瘤细胞干性相关的研究结果多指向KLF-4。而其他如KLF-5/6/7/8等作为KLFs家族的一员，推测其同样参与肿瘤干细胞干性的建立及维持。

2.1 KLF-4与肿瘤干细胞的相关性

KLF-4是一种重要的肿瘤抑制因子，有多项临床研究表明KLF-4在口腔癌、鼻咽癌及前列腺癌等肿瘤中均呈低表达，并且多因素分析表明低水平的KLF-4表达可能是导致肿瘤预后不良的重要不利因素[46-48]。KLF-4也是一种重要的细胞周期调节因子，早在2003年，Chen等利用cDNA微阵列分析的方法在已建立的含有诱导KLF-4基因的人细胞系中鉴定了KLF-4的靶基因。研究发现表达发生显著变化的基因中许多上调基因是细胞周期的抑制因子，而许多下调基因是细胞周期的启动子[49]。结果提示KLF-4在细胞自我更新上的重要调控作用。

另一方面，KLF-4还是维持细胞干性，调节细胞分化的重要因素，是诱导体细胞脱分化为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS )的4个因子之一[50]。Takanashi与Yamanaka等筛选了不同的基因组合，最终用Oct-3/4，Sox2，c-Myc，KLF-4的基因组合成功将成纤维细胞诱导为iPS细胞。而此后其他研究者在此基础上用该组合将结果在膀胱上皮细胞等其他组织细胞上重现[51]。此外，在干细胞与肿瘤干细胞中，KLF-4均能通过端粒酶逆转录酶通路(telomerase reverse transcriptase,TERT)保持端粒酶活性。且KLF-4尚能通过促进β-catenin的结合来反式激活TERT[52]，提示了KLF-4与细胞干性在肿瘤发生过程中的密切关系。这充分表明了KLF-4在细胞干性维持上的潜能。

研究发现KLF-4抑制肿瘤的效果是通过诱导CDK抑制因子CDKN1A和CDKN1B的表达及抑制细胞周期蛋白D1(cyclin-D1)和细胞周期调节因子FoxM1(forkhead box M1)的表达来抑制肿瘤的生长[53-55]。而CDKs被证明与细胞干性以及癌基因Myc的表达密切相关[20，56]。表明KLF-4在细胞干性维持及细胞自我更新过程中起重要作用。据此推测其可通过调节肿瘤干细胞周期进一步调控肿瘤的生长分化，是联系肿瘤的生物学行为与肿瘤干细胞干性的重要桥梁。

2.2 KLF-7与肿瘤干细胞的相关性

KLF-7是KLFs/SP转录因子蛋白质家族的一员，在成体各组织中低水平广泛表达，因此又称UKLF(ubiquitous Krüppel-like factor)[57]。目前研究表明KLF-7是癌症、肥胖症、Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、面部发育异常、氧化磷酸化缺陷和Ⅰ型自身免疫性胰腺炎等疾病的相关基因。

Ciribilli等[58]对人类癌症中存在的一种过度表达基因c-Myc的研究发现，在癌症样本中，KLF-7对c-Myc基因的表达起到协同转录作用，而在非癌症样本中则不然。而另有研究通过对比胃癌样本与正常邻近组织样本的KLF-7表达量发现，KLF-7在实验组中表达有显著的升高，且其表达量与患者预后呈负相关[59]。这提示KLF-7在癌症发生及发展中可能有表达增高的情况，并起到调节肿瘤发生与发展的作用。

Caiazzo等通过对神经干细胞中KLF-7表达水平的研究发现，KLF-7表达水平受多种干细胞自我更新的调节因子如Oct4和Nanog的调控[60]。过表达或者沉默KLF-7基因后，神经外胚层和中胚层多个谱系细胞的分化潜能发生了变化。这表明KLF-7 在维持多能干细胞干性中起到了重要的作用，并对干细胞的多种分化潜能具有调控作用。而Klein等对角膜上皮细胞分化的研究发现KLF-4和KLF-5可促进角膜上皮分化[61]。而KLF-7在许多过程中可拮抗促进角膜分化的KLF-4，使角膜上皮维持在祖细胞状态。这表明KLF-7在该过程中具有细胞干性维持的重要作用。

2.3 KLF-8与肿瘤干细胞的相关性

KLF-8也是KLFs家族中一种重要的细胞周期调节因子，与KLF-7类似，KLF-8在EMT的激活过程中也起到重要作用[62]。KLF-8与肿瘤的发生发展也密切相关，在肝癌、胃癌、肺癌等许多恶性肿瘤中均存在过表达现象。

Shen等对KLF-8在肝癌中的表达研究发现，KLF-8在原发性肝癌肿瘤组织、肿瘤远处转移组织及肝癌干细胞中均有高表达，且KLF-8下调的肝癌细胞相比于对照组，在相同剂量索拉菲尼及顺铂作用下能够观察到更明显的细胞凋亡现象，说明KLF-8与肿瘤药物敏感性相关。且KLF-8的表达与患者预后呈负相关。该研究者还发现下调KLF-8的肝癌细胞后核β-catenin蛋白表达量降低，并且β-catenin下游基因，如c-Myc、cyclin D1等mRNA表达也显著降低，而Wnt通路激活剂LiCl则能消除KLF-8下调的影响。研究者据此认为KLF-8可通过激活Wnt/β-catenin通路维持肿瘤细胞干性，促进化疗耐药[63]。

另有学者在胶质母细胞瘤细胞的研究中采用异种移植模型研究KLF-8对肿瘤生长及替莫唑胺敏感性的影响，发现在KLF-8缺失的情况下，胶质瘤细胞对替莫唑胺表现出更大的敏感性，导致细胞生长受到抑制，凋亡增强，而KLF-8过表达的情况下情况则相反[64]。

2.4 其他KLFs与肿瘤干细胞的相关性

KLF-5也是一种细胞周期调节因子，在结肠癌细胞中其表达的缺失会降低Wnt/β-catenin通路的激活。与KLF-4类似，KLF-5同样可诱导iPS细胞的形成[65]。另有学者发现在食管癌肿瘤干细胞样细胞中可发现KLF-5的上调[66]，表明KLF-5同样与肿瘤细胞干性维持及自我更新有关。

Ying等通过研究胶质母细胞瘤中KLF-9的表达发现KLF-9是一种重要的转录抑制因子，它可通过调节胶质母细胞瘤中与肿瘤发生及干性调节相关通路(如整合素通路)，来抑制胶质母细胞瘤的干性[67]。

3 总 结

以目前的研究看来，肿瘤干细胞理论对于恶性肿瘤发生、发展、转移等行为的解释具有较好的临床及实验依据。而KLFs家族在肿瘤行为中起到了非常重要的作用，这可能是通过调节肿瘤干细胞的多能性来实现。从上述研究来看，KLF-4/7/8等均表现出了这样的趋势。然而目前对于KLFs的研究，相较于KLF-4，对其他KLFs的研究仍相对不足，对于KLFs与肿瘤干细胞相关性的直接研究也较少，且许多相关研究仍停留在细胞实验及体外动物实验。其能否准确反映肿瘤在人体内的活动仍然有待研究。

研究肿瘤干细胞发生的机理，基因突变的位点，相应的信号通路，通过肿瘤干细胞发现新的靶向治疗的途径，将能有效提高恶性肿瘤患者的生存率与生活质量。而其中KLFs家族在对于肿瘤干细胞的进一步研究中应是有潜力的切入点。