肾脏去细胞和再生研究进展

黎婷

（芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖241000）

0 引言

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）及其并发症对人类和动物健康造成严重威胁，全球CKD成年患病率在13%左右。CKD不断进展将导致终末期肾脏疾病，甚至其它器官功能也会衰退。CKD中肾癌的发病率和死亡率在全身肿瘤中占2%［1］，切除肾脏及其周围组织是目前被广泛应用于肾癌临床治疗的的一种方法，但对于单侧肾、双肾肿瘤、以及对侧肾脏受损等患者来说，行切除术会造成严重的负面后果。肾移植可从根本上治疗肾脏实质损伤，但是供体严重缺乏等问题很难取得实质性突破，这些问题促使了肾再生修复工程的迅速发展。一种解决方法是利用干细胞治疗，研究发现，出生后哺乳动物的肾部分切除后的修复，可能是肾的干细胞迁移到受伤区域，增殖分化成体细胞，但肾的构成极为复杂，限制了临床再生治疗的发展［2］；另一种解决器官短缺的方法是使用动物器官进行异种移植，将动物器官去细胞后接种患者细胞，可避免免疫排斥反应，猪肾制成的去细胞支架，与猴及狗制成的肾支架相比，细胞的粘附性、生存和增殖效果好，但是应用到临床肾再生治疗上仍有待完善［3］。

1 组织再生学

终末期肾病患者的增多、器官供体的短缺、异种移植的临床实施性等问题，促进了组织再生学的发展。组织再生学中重建一个新组织需要三大元素：种子细胞、支架材料和生长因子。临床目前应用于组织工程中的支架材料分为三类：化学合成支架、天然成分支架和纳米三维支架，但是存在着组织相容性和细胞粘附性差等问题。随着再生医学的发展，出现了全器官去细胞支架，能最大程度的保留脏器的大体形态、天然的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和超微结构，因其具有良好的生物安全性和生物相容性，以及具有细胞识别及黏附位点等优势而被广泛用作组织工程支架材料。完整的天然ECM，比如真皮、心包、小肠和膀胱等，已经广泛应用于外科再建手术，因其保存了葡糖氨基聚糖类（GAGs）和纤维蛋白（如胶原蛋白、弹性蛋白和层黏连蛋白等），可维持三维立体网络结构供种子细胞附着，并存在着一些复合生长因子，可通过信号传递调节基因表达来诱导调节细胞的生长、增殖、分化等［4］。ECM与种子细胞之间“动态互动”，这对肾组织的再生与修复有着重要的意义［5］。

肾的解剖结构和组成极为复杂，制备全肾去细胞支架除了保存天然立体结构外，还要保留其过滤功能的显微结构。研究发现，肾ECM支架移植后，可促进血管发生，募集循环的祖细胞、免疫排斥性最小化，还能减少疾病传播的风险［6］。2009年，我国刘春晓［7-8］首次制备出大鼠全肾去细胞支架；近十年来，国内外学者对全肾去细胞生物支架进行的初步细胞培养验证了支架的组织相容性，再细胞化后检测肾功能，为肾的再生修复工程奠定了基础［9］。

1.1 全器官去细胞支架制备方法和影响因素

去细胞过程涉及化学、物理和酶处理过程，即使用洗涤剂、盐、酶及物理手段，去除组织和器官中的细胞，保留ECM中的部分蛋白质，如胶原蛋白，可大大减少免疫排斥性。因此ECM接种患者的种子细胞，甚至构建一个全新器官，可将排斥的可能性降至最低。目前最简单有效的去细胞方法就是化学灌注法，即利用洗涤剂或酸，通过破裂细胞膜和分离细胞成分去除天然细胞。常用的化学试剂如：过乙酸（去胞核效果好，对ECM结构影响极小）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，非离子洗涤剂，在心脏瓣膜去细胞残留物最有效）、1%SDS（去除器官中央部分细胞，较Triton X-100有效）、脱氧胆酸钠（NaDOC，阴离子去污剂，可完全去除器官的胞质蛋白）。研究发现，分别使用Triton X-100和1%SDS去除猪肾细胞，前者保留更多的纤维蛋白和生长因子，在细胞实验中细胞的存活率、粘附性和增殖效果也更好，目前去细胞过程中多将二者结合使用，今后或可设计更有效的方法以制备质量更好的支架［4］。

为保存结构完整性，尽可能去除残留DNA，去细胞过程中使用的方法极为重要。化学灌注的去细胞过程受器官大小、重量、厚度、细胞密度、脂类含量等因素影响，洗涤剂浓度、灌注压力、时间、流速有所改变。研究发现，分别使用0.125、0.25、0.5和1.0%的SDS分别灌注大鼠肾脏4小时和8小时，免疫组化检测显示去细胞效果差异性不显著，但0.125%的SDS灌注4小时可保留更多的生长因子。低浓度SDS恒压灌注去细胞前，将器官冷冻或者使用渗透冲击细胞膜，去除99%的DNA同时，能更好的保留ECM微结构，植入的种子细胞增殖速度更快［10-13］。

1.2 去细胞支架灭菌和效果评价

无论是体外、体内研究，ECM支架都要进行灭菌，以去除所有内毒素及可能的细菌和病毒DNA。常用的灭菌方法包括射线照射、环氧乙烷、酸性溶液、抗生素、乙醇或者过氧乙酸处理。酸性溶液处理会不同程度的破坏ECM微结构，也会影响再植入种子细胞的粘附性和增殖率。γ射线照射或环氧乙烷处理会改变支架微结构，损失胶原纤维和GAGs，降低种子细胞增殖率。制备肾支架过程中，常用PBS稀释抗生素和抗真菌药物后联合灌注灭菌，而近期研究显示1 M NaCl溶解0.2%过氧乙酸灭菌效果较其它方法更好［4］。

去细胞过程中纤维蛋白和生长因子都会大量减少，更好的保留ECM的微结构、纤维蛋白和生长因子的去细胞支架，植入的种子细胞生长和增殖越好。评价肾去细胞后支架ECM的三维结构，目前常用免疫组化法检查支架ECM中肾小管、肾小球、血管的保留水平，以及去除细胞的水平（可能导致免疫排斥），用扫描电镜检查支架ECM中肾小球基膜的保留水平，使用原子力显微镜等方法检查去细胞器官的力学水平，器官去细胞刚性降低导致坍塌。ECM中生长因子的保留水平与其生物功能相关，影响种子细胞分化成组织特异性细胞，从而影响器官去细胞后再生重构；生长因子水平也影响种子细胞的代谢活性及ECM与细胞间的互动性［14］。去细胞方法不能100%去除肾脏细胞的同时，不损伤ECM结构和蛋白成分，要求每mg干重ECM的DNA残留量＜50 ng［15］。

1.3 肾脏再生的种子细胞

肾脏是一种复杂性器官，包含至少26种细胞，肾小体就由血管内皮细胞、系膜细胞、足细胞、壁细胞、球旁细胞、致密斑、球外系膜细胞等多种细胞构成。植入的多种种子细胞中，干细胞因其多潜能性脱颖而出，例如不论是从肾动脉，还是输尿管灌注胚胎干细胞，都会在肾小管、血管，及肾小球中增殖，并分化成上皮和内皮细胞，但因伦理问题备受争议［16］；髓间充质干细胞已经用于肾脏修复和再生［17］；由自身体细胞重排诱导分化得到的多潜能性干细胞，可分化成胚胎肾脏祖细胞，并在血管紧张素作用下分化成足细胞［18］。体外肾脏结构的重构，包括含有足细胞的血管化肾小球，以及管腔通畅的近端小管和远端小管，因此种子细胞的重要性不言而喻，干细胞将在今后的肾脏再生中发挥重要作用。

2 全肾去细胞支架再细胞化

通常使用注射泵或蠕动泵，将细胞悬液匀速的经过肾动脉或者输尿管灌注，将全身去细胞支架植入种子细胞，或通过注射器将细胞悬液均匀的注射到全肾去细胞支架的皮质区域。全肾去细胞支架再细胞化的理化性质和功能评价，包括ECM结构、细胞粘附性、细胞增殖分化和迁移情况，以及再生的肾脏功能等，例如使用免疫组化检测ECM的立体结构（肾小球的平均直径、肾小球毛细血管腔、动静脉的完整性等）与细胞的粘附及迁移情况；使用免疫染色或者实时定量PCR检测细胞增殖分化情况；使用荧光显微镜检测电解质的重吸收、测定水解酶活性来监测氨基酸转运功能、或者利用扫描电镜、放射性核素等方法检测肾功能［4］。

2009年开始，Ross［19-20］团队开始进行全肾去细胞支架再细胞化的研究，通过蠕动泵灌注法植入种子细胞后，检测到细胞活力和增殖水平好，并且从入球小动脉和肾小球分别迁移到出球小动脉和小管周的毛细血管网。2013年，Ott［21］团队将肾脏去细胞基质支架体外联合内皮细胞与上皮细胞培养后，成功将“新生肾脏”移植入大鼠体内，初步观察其具有一定排尿功能。2014年，梅劲［22］团队将全肾去细胞支架的下方1/3部分，吻合缝合至活体大鼠切除了约1/3肾下方实质组织的肾处，研究显示祖细胞从损伤的肾组织迁徙到移植的支架中，表明支架中ECM良好的理化条件诱导了附近的肾祖细胞的增殖和分化，出现血管发生和一定的再生肾功能。但直至目前的全身去细胞支架再细胞化，远不能达到临床实际应用的要求。

3 展望

通过灌注法获得含有天然ECM的全肾去细胞支架，在肾衰竭病患的肾再生和修复中具有巨大的应用前景，在3D打印之外，为肾再生医学的治疗提供了一种新的思路。进一步完善去细胞方法以保留ECM更好的理化条件、合适的种子细胞及全肾去细胞再细胞化后种子细胞的分化及更好的实现肾功能，都是今后将全肾去细胞支架再细胞化后应用到临床移植前期需要解决的关键问题。