支架材料在牙髓血运重建术中的研究进展

余梦佳，姜治伟，邓淑丽，杨国利

牙髓血运重建技术(dental pulp revasculariza-tion)是由Iwaya等[1]在2001年首次提出的治疗年轻恒牙牙髓病与根尖周病的方法，旨在通过彻底有效的根管消毒，保护牙髓干细胞、牙乳头间充质干细胞和牙周韧带干细胞，并为其提供良好的干细胞增殖和分化的微环境，从而促进牙根的继续发育。相较于传统的根尖屏障术、根尖诱导成形术，牙髓血运重建术可以使患牙根管内硬组织继续形成，牙根长度和根管壁厚度增加，根尖孔闭合，甚至牙髓重获活力，让牙髓再生成为可能，降低远期根折的风险，现如今已越来越多被应用于临床。本文将从牙髓血运重建术的操作步骤和基本要素展开，重点就支架材料在其中的应用进行综述。

1 牙髓血运重建术的临床步骤及基本要素

牙髓血运重建术通常需要患者两次就诊来完成。首诊时通过大量1.5%次氯酸钠和生理盐水或17%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)反复冲洗根管后，封入氢氧化钙或者低浓度的三联抗生素糊剂，以达到彻底消毒根管、控制感染的目的。复诊时评估疗效，若患牙无持续感染症状，则在17% EDTA冲洗及干燥根管后，使用预弯的K锉超出根尖孔2 mm，引血至釉牙骨质界下2～3 mm，待血凝块形成，覆盖3 mm左右三氧化矿物凝聚体(mineral trioxide aggregate, MTA)或iRoot BP等生物陶瓷材料，并定期随访、拍片[2]。

牙髓血运重建术的成功与否离不开干细胞、生长因子、支架这三大要素[3]。目前认为干细胞参与组织的再生与修复；生长因子促进干细胞的增殖与分化；而支架作为一种三维结构的支持物，可供干细胞的粘附，并为其增殖和分化提供非常有利的环境，是牙髓血运重建术必不可少的一部分，也是现阶段研究的热点。

2 牙髓血运重建术的支架材料

理想的支架材料应该具备的条件有：可以模拟细胞外基质的结构；为牙髓血运重建术中的每一组分提供最佳的条件；生物相容性好；可降解[4]。可应用于牙髓血运重建术的支架材料种类繁多，除了最常用的根尖引血外，其他替代品主要分为天然材料和人工合成材料两大类。前者包括富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)、富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)、血小板颗粒(platelet pellet, PP)、富含生长因子的血浆(plasma rich in growth factors, PRGF)、胶原基质、壳聚糖、脱细胞牙髓支架等；后者包括聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)(Poly(d,l-lactide-co-glycolide), PLGA)、聚左乳酸(poly(l-lactic acid), PLLA)、β-三磷酸钙盐/壳聚糖(β-tricalcium phosphate/chitosan)、双向钙磷(Biphasic calcium phosphate)、胶原-羟磷灰石复合材料等。但其中的一大部分材料目前仅停留在实验室研究阶段，尚未用于临床。

2.1 根尖引血

根尖引血，是指通过K锉等器械刺入根尖组织，以诱导其出血形成血凝块。该血凝块不仅可以作为支架，传递根尖乳头的大量未分化的间充质干细胞进入根管内，还可以提供较为丰富的生长因子，促进干细胞的生长与分化[5]。研究显示，相比于全身血液，根尖引血可以使干细胞表面标记物的表达量显著提高[6]。然而受根尖孔尺寸大小的限制，髓腔内往往血供不足，导致该部位不能实现充分的血管重建，因此想要在根管内形成牙髓样组织是十分困难的[7]。事实上，临床上还没有真正实现过所谓的“牙髓再生(pulp regeneration)”。Wang等[8]通过对行根尖引血来进行牙髓血运重建的年轻犬牙进行组织学检查，发现即使根尖区甚至根管内炎性浸润依然存在，牙髓样组织未完全形成，但牙根的伸长、增厚仍然可以继续，不过根管壁内没有观察到牙本质样组织的形成，见到的是细胞牙骨质样、骨样、牙周韧带样组织。Meschi等[9]则是通过免疫组化的方法在人年轻恒牙中得到了类似的结果。以上提示着根尖引血引入根尖区骨髓或者牙周膜中的前-成骨细胞和前-成牙骨质细胞后，可能欠缺诱导其分化成为牙髓干细胞的某些生长因子，故使得牙髓血运重建术比起组织再生，倒更像是损伤修复(wound repair)[10]。

2.2 自体血输送

事实上，很多患牙会面临根尖引血不成功的窘境。已有证据显示，根管内血凝块的缺如会对牙髓血运重建术的结果产生负面作用[11]。因此临床上会用采集自体静脉血，并将其注入根管内的方式代替传统的根尖引血[12]。而在多根牙中，为解决其中某一根管引血不足的问题，可以考虑将临近根管内富余的血液输送至没有出血的根管。Nosrat等[13]在下颌第一磨牙近中根引血不足的情况下，分别给予了将远中根内新鲜血液引入近中根根管和没有任何补偿方法这两种措施，结果发现不采取补救方法组只能观察到根管壁的增厚，而没有牙根的延长；引入血液组的牙根发育情况则更为理想。

2.3 相关血制品

近年来也有越来越多的科学家尝试从采集到的静脉血中提取有效成分，以寻求更好的疗效。

2.3.1 PRP PRP是将人或动物的全血通过离心的方式得到的富含高浓度血小板的血浆，且在添加入凝血酶后可变为胶状物。因PRP富含的大量生长因子可以促进细胞生长，保持牙髓组织的活力，故临床上遇到根尖引血不充足的情况，也会将其作为一种备选方案。

Torabinejad等[14]首次将PRP以支架材料的形式，应用于牙髓血运重建术中，成功诱导了患有根尖炎症的前磨牙的牙根发育，并且使坏死的牙髓重获活力。Alagl等[15]用CBCT进一步对牙根长度、病损范围与骨密度进行分析，发现以PRP为支架治疗12个月后，患牙根尖周病变的范围明显缩窄，骨密度明显增加，其中93%的牙齿展现出不同程度的牙根延长与根尖孔的闭合，并且所有患者的症状和体征都消退了。另一项针对猎兔前磨牙的组织学检查亦显示：使用PRP后，患牙根管壁明显变厚，根管内有细胞牙骨质样组织长入，而且使用Fisher精确检验法与传统的根尖引血组比较，并未发现两组在根尖孔闭合、新组织形成情况中有显著的差异[16]。

2.3.2 PRF PRF是一种区别于传统PRP技术的新一代血小板浓缩物，制备时不需要额外添加生物制剂，而是在血样采集后直接快速离心得到的纤维蛋白凝块，相比PRP制备步骤简单且更容易获得。PRF中富含的纤维蛋白可以将血小板和生长因子以化学键的形式结合起来，延长生长因子释放的时间[17]。

Adhikari等[18]报道1例采用PRF治疗后第12个月意外折断而拔牙的病例，组织病理学结果示，根管壁内见胶原性基质并周围形成的类似于无细胞牙骨质样的硬组织结构，小牙片可见根尖孔的闭合、根管壁的增厚以及根尖周病变的愈合，提示以PRF作为支架材料也可以取得满意的疗效。

2.3.3 PP PP是自体血小板浓缩物的另一来源，它是在PRP的基础上再次离心(4000r/min, 10min)，去除上层乏血小板血浆后所得的沉淀物。但相较PRP、PRF，PP中血小板浓度更高，是PRP的17倍之多[19]，且因其凝胶特性，相比PRP有更好的粘接性。Ulusoy等[20]首次用PP治疗牙髓坏死的年轻切牙，并成功观察到牙根长度和宽度的增加，可以取得与根尖引血、PRP、PRF类似的疗效。

2.3.4 PRGF PRGF则是针对PRP制备过程中因操作效率低、动物来源凝血酶的添加以及基础个体的差异所导致的预备质量难以控制在相似水平而提出的更新的概念[21]，其制备采用的是BTI技术[22]——将加入柠檬酸钠的全血按480g，8 min离心，从上往下依次得到：血浆、白细胞和红细胞，使用微吸管吸取血浆中最底层且富含大量血小板和生长因子的物质，并添加氯化钙进行活化，得到的就是PRGF。

PRGF可以增强细胞增殖与分化，促进血管生成以及具有加速组织愈合和再生的潜能，故也有学者将其作为支架材料应用于年轻犬牙[22]。但研究发现虽然PRGF组也有促进根尖闭合、管壁变厚的作用，但相比较于根尖引血组，没有展现出更大的优势。而且考虑到制备PRGF需要专门的设备和额外的成本，故不推荐使用[22]。

2.4 其他天然材料

其他可应用的天然材料还有胶原蛋白和壳聚糖。Zhang等[23]将海绵状牛Ⅰ型胶原基质作为三维支架培养人牙髓干细胞，观察到矿化的细胞外基质的沉积以及牙本质涎磷蛋白的表达。Kwon等[24]称使用肉桂醛交联胶原支架后还可以增加人牙髓干细胞的粘附、增殖与分化。Altaii等[25]在绵羊感染的年轻恒牙中，通过根尖引血形成血凝块，其上覆盖了一层可吸收的Bio-Oss胶原膜，6个月后可以观察到显著的牙根发育，且与拥有完整健康牙齿的对照组比没有明显差异。另一项基于人体的随机对照临床实验研究也显示：将Bio-Gide胶原膜覆盖于根尖引血产生的血凝块上会比单纯的根尖引血组有更好的牙颈部抗折性能，因为胶原膜的使用可以有效防止上部MTA等生物陶瓷材料的塌陷，保持根管内血凝块的稳定，并协助其释放生长因子，促进牙根中1/3处牙本质壁的发育及增厚，降低后期牙颈部折裂的风险[26]。而在Thibodeau等[11]的实验中，却发现将鼠尾I型胶原溶液应用于年轻犬牙后，与根尖引血组相比，疗效较差；且若在根尖引血的基础上再添加I型胶原溶液，也未发现比普通的根尖引血组效果更好。由此可见，胶原蛋白的制剂类型对于牙髓血运重建术的优化结果影响较大。临床上可考虑在根尖引血的基础上联合使用可溶性胶原膜共同作为支架，帮助新生组织长入根管内，防止封闭材料的塌陷或引血不足的情况下对疗效产生的影响[27]。

壳聚糖是一种性能优良的生物材料，它被作为细胞的三维载体，广泛用于组织工程领域。研究表明发现壳聚糖支架和TGFβ1可以增强人脱落乳牙的多能干细胞的增殖和成骨分化，增加矿物质的沉积，将来或有望应用于牙髓血运重建术[28]。

2.5 合成材料

许多合成材料诸如PLGA、PLLA、β-三磷酸钙盐/壳聚糖、双向钙磷、胶原-羟磷灰石复合材料等，因具有无毒、可降解、理化性质可精确控制等特点，也是牙髓血运重建术的潜在支架材料。已有证据表明，PLGA/明胶电纺薄片可以为牙根再生创造合适的微环境[29]；在PLLA支架中接种人脱落乳牙干细胞可以为牙髓组织工程提供丰富的干细胞来源[30]；β-三磷酸钙盐/壳聚糖复合支架可以上调人牙周膜细胞中碱性磷酸酶和骨桥蛋白的表达量，促进人牙周膜细胞向成骨细胞和成牙骨质细胞表型分化[31]；双向钙磷支架则可以促进人牙髓细胞的分化，并有利于牙本质的再生[32]；而将胶原-羟磷灰石复合材料SynOss Putty联合根尖引血应用于牙髓血运重建术时，相比单纯的根尖引血可以获得更确定的疗效[33]。

2.6 新型材料

现在，有更多的学者跳出原有的框架，将目光投向新型的支架材料。考虑到牙髓血运重建术步骤中的抗生素糊剂和化学冲洗会影响到干细胞的活性，有学者建立了基于纳米纤维的根管内药物传输系统，既有效控制根管内感染，又不影响牙髓干细胞在牙本质上的附着和增殖[34]。也有学者认为未来应用于牙髓再生的材料必须是可注射的，故而提出以自组装肽水凝胶PuramatrixTM作为支架，将牙髓干细胞播种至此，发现细胞健康成长，并可以表达具有成牙本质细胞分化特征的标记物[35]。另有学者合成星形聚合物并自组装成了独特的纳米纤维海绵状微球，以此作为携带人牙髓干细胞的进入根管内的载体，研究发现此微球可以显著增强人牙髓干细胞的附着、增殖、牙源性分化和血管生成[36]。并且因着牙髓细胞外基质特有的复杂性难以模拟，有不少学者尝试将脱细胞后的牙髓组织作为支架，最大程度还原牙髓细胞赖以生存的微环境。Matoug-Elwerfelli等[37]发现脱细胞牙髓支架可以保持原有组织的有效结构与组分，不仅没有毒性，也不会降低牙髓干细胞原有的活力，且支持细胞的再黏附。Song等[38]则是总结了前人制备脱细胞牙髓支架的三种方法，均可以观察到较好的形态与功能，从中选择了脱细胞效率最高的方法，并将根尖牙乳头干细胞(stem cells of the apical papilla, SCAP)接种于此，发现SCAP在三维方向都显示出良好的增殖与粘附性能，且在靠近牙本质壁处其形态更为扁平，伴有突起伸入牙本质小管，细胞内牙本质标记物表达量也明显增加。而Xuan等[39]更是成功地将离体扩增的人乳牙牙髓干细胞团块植入外伤的年轻切牙中，在长达24月的随访中，未观察到不良症状，且患牙牙根伸长、根尖孔闭合，激光多普勒血流仪显示根管内血管再生，温度测试亦示牙神经活力有所恢复。对一颗治疗后因再次外伤拔除的患牙进行组织学染色，可以发现整个牙髓组织在三维方向的再生，包含了成牙本质层、结缔组织和血管，类似于正常的牙髓。以上新型材料为牙髓再生提供了新的思路和可能性，未来值得更深入的研究。

3 临床上不同支架材料的比较

虽然支架材料种类繁多，但目前技术成熟且已被用于临床的主要限于根尖引血和各种血小板的衍生物。关于这些不同支架材料疗效方面的探讨很多，Murray等[40]从Medline中筛选到12篇比较根尖引血、PRP、PRF远期效果的临床研究，并进行了meta分析，发现从1年后根尖孔闭合的成功率来看，PRF(85.2%)>PRP(85.1%)>根尖引血(58.8%)；从牙根延长的成功率看，PRF(74.1%)>PRP(64.2%)>根尖引血(64.1%)，但差异没有统计学意义；从根尖周组织病变愈合成功率看，PRF(100%)=PRP(100%)>根尖引血(88.9%)。总体来看，血小板浓缩物因具有增加细胞增殖与分化、促进血管生成和胶原合成的潜力，相较常规的根尖引血表现出更卓越的临床疗效，且据Ulusoy等[20]的前瞻性随机试验报道，PRF、PRP远期发生根管阻塞的概率也低，是一种理想的支架材料。但因其需要特殊的设备或药物，使治疗成本大大增加，且不少小朋友因恐惧针头与血液，难以配合护士抽血，大大限制了其在临床的推广。

其他支架材料凭借其各自特点在体外实验中均取得良好结果，但关于动物体内的研究甚少，其应用于牙髓血运重建术后的确切疗效也未可知，且目前制备流程尚无统一标准，今后仍需要更多的探索与深入的研究。

4 结论

临床上将根尖引血作为标准的牙髓血运重建术程序的一部分是明智的，在引血困难或不足的病例，可考虑制备PRP或PRF作为支架材料，或配合胶原膜的使用，都能取得令人满意的疗效。合成及新型支架材料为血运重建术提供了新的可能性，前景可期，尚需临床上进一步的验证。