单细胞测序研究进展及其在口腔医学中的应用

郑明霞，谭俊龙，刘湘宁，2，张永彪，王晓刚

细胞作为绝大多数生物体的基本单位，拥有一套复杂而精细的生命操作系统，既具有普遍的统一性，也具有独特的异质性。对于多细胞生物体如人体而言，从单个受精卵到构成机体各个组织器官和系统的数亿个细胞的胚胎发育机制以及机体从正常生理情况发展到疾病状态经历了什么样的细胞变化历程等问题，受到了研究人员的普遍关注。但由于技术障碍，先前的研究仅基于常规大体测序(bulk sequencing)，使得对细胞的研究处于群体细胞测序水平。自2009年汤富酬团队首次报道单细胞mRNA测序(single cell mRNA sequencing，sc-mRNA-Seq)以来[1]，对单细胞的研究迅速进入火热阶段。近年来，各种单细胞测序技术不断涌现，分析工具日益完善，单细胞的神秘面纱逐渐被揭开，生命科学研究得到了迅猛发展。

1 单细胞测序

1.1 单细胞测序的技术流程

单细胞测序(single-cell sequencing，SCS)的流程包括：(1)单细胞分离：用于分离多个细胞以进行后续分析。目前单细胞分离技术主要包括荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)[2]、显微操作(micromanipulation)以及微流体技术(microfluidics)[3-4]。微流体技术根据基本原理又可细分为阀门(valves)、液滴(droplets)、纳米孔(nanowells)三种技术。其中，阀门技术易于操控；液滴技术以高吞吐量著称；纳米孔技术胜在操作上的简便[5]。(2)测序：包括先扩增序列再测序的第二代测序(second generation sequencing，SGS)即下一代测序(next generation sequencing，NGS)和直接测序的第三代测序(third generation sequencing，TGS)即单分子测序(single-molecule sequencing)[6-7]。第二代测序扩增序列的目的是增加用于检测的序列样本总量。全基因组扩增(whole-genome amplification，WGA)的方法包括多重退火和基于环路的扩增循环(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)[8]、基于等温反应的多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)和基于热循环的简并寡核苷酸引物聚合酶链式反应(degenerate oligonucleotide primed-polymerase chain reaction，DOP-PCR)[9-14]。其中，MDA的单核苷酸变异体检出率更高而MALBAC和DOP-PCR在测量拷贝数变异方面较佳[15-16]。全转录组扩增(whole-transcriptome amplification，WTA)的方法主要有基于PCR的方法(PCR-based amplification methods)如多重(multiplexing)扩增方法和基于体外转录的全转录组方法(invitrotranscription based WTA-methods)如使用条形码的多重线性扩增(multiplexed linear amplification)[17-19]。单分子测序可以消除扩增偏差，但单分子测序存在错误率高、吞吐量低及测序效率低等不足[20]。(3)数据分析：用于移除干扰信息如接头序列(adapter)、连接序列(linker)和标签序列(barcodes)等，对剩余的序列信息进行分析。常见的分析流程是通过基础流程Cell Ranger将原始数据(raw base call，BCL)拆分为FASTQ文件[21-22]，并生成基因表达矩阵。在下游分析中，细胞聚类常利用Seurat软件[23]；伪时间(pseudotime)分析则多采用monocle软件[24]。在细胞聚类中，可以通过主成分分析(principal component analysis，PCA)进行线性降维[25]，再使用tSNE执行非线性降维[26]，将结果可视化。随后寻找每个聚类中显著表达的基因以鉴定高度变化基因。

1.2 单细胞测序的内容

如图1所示，单细胞测序涉及基因组、表观组(包括DNA甲基化、染色体可及性和染色质拓扑学等)、转录组以及空间组等内容。

1.2.1 单细胞基因组测序 人类生物学和医学的中心问题是关于人类细胞谱系树(human cell lineage tree)的问题，即其在发育、生长、更新、衰老以及疾病过程中的结构、 动力学和变异性如何的问

图1 单细胞测序

题。由于细胞分裂期间DNA的非绝对精确复制，细胞便被赋予了独特的基因组特征[27]。单细胞基因组测序既可检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)或单核苷酸变异(single nucleotide variations，SNVs)，也可检测拷贝数变异(copy number variations，CNVs)或拷贝数畸变(copy number aberrations，CNAs)以及碱基的插入和缺失(insertions and deletions，Indels)等[28]，成为剖析肿瘤、神经生物学以及发育过程中基因组异质性的有力工具[29]。如Wang等[30]将单细胞全基因组测序(single-cell whole genome sequencing，scWGS)用于描绘精子减数分裂重组活动的综合景观，揭示了精子的基因组多样性对个体基因组编辑的影响；Navin等[31]利用单核测序(single-nucleus sequencing，SNS)对乳腺癌进行肿瘤群体结构和进化研究，发现单克隆扩增是原发性肿瘤的形成模式，推翻了肿瘤进展的渐进模型。

1.2.2 单细胞外显子组测序 外显子组虽然只构成基因组的一小部分，却有绝大多数的致病性变异发生在该区域[32]，加上单细胞全外显子组测序(single-cell whole-exome sequencing，scWES)可以降低全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)引起的基因座间偏差和提高碱基覆盖率[33]，因此常用于编码序列的SNVs分析。如Hou等利用scWES进行SNVs分析，揭示了原发性血小板增多症和肾透明细胞癌的肿瘤内部遗传结构，为进一步探索肿瘤的克隆进化奠定了基础[34-35]。

1.2.3 单细胞表观组测序 性状的改变除了受DNA序列改变的控制外，还受遗传物质修饰如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调节等过程的影响。即遗传物质修饰也可以记载遗传信息，用于解释基因型与表型两者的关系[36]。单细胞表观组研究涉及的内容见图1。

一般来讲，基因组DNA甲基化抑制基因的表达；而非甲基化促进基因的表达。单细胞DNA甲基化测序主要用于检测基因组DNA中的胞嘧啶特别是CpG二联核苷酸位点是否被甲基化修饰[37]，可用于胚胎发育学研究，如通过对生殖细胞系进行分析可以了解印记基因在胚胎和胎盘组织转录调控中的关键作用[38]，有助于理解无性生殖失败的原因。新近的单细胞DNA甲基化测序方法有单细胞亚硫酸氢盐测序(single-cell bisulfite sequencing，scBS-seq)[39-40]、单核甲基胞嘧啶测序(single-nucleus methylcytosine sequencing，snmC-seq)以及单细胞组合索引甲基化分析(single-cell combinatorial indexing for methylation analysis，sci-MET)等[41-42]。

不同状态下的细胞拥有不同的顺式作用元件活性位点如启动子、绝缘子和基因座控制区等，这些位点具有转录因子可及性，是染色体调控的基础。染色质对DNase I高度敏感的活性区域称为DNase I高敏位点(DNase I Hypersensitive Sites，DHS)，DNase I 高敏性常用作染色体可及性的测量指标。哺乳动物细胞的DHS定位，能够提供转录调控元件和染色质状态的重要信息，有助于研究顺式作用元件可及性差异的转录因子驱动机制。如Denny等[43]通过比较原发肿瘤和转移灶肿瘤细胞的全基因组染色质可及性特征，发现转录因子Nfib可通过广泛提高染色质可及性来促进小细胞肺癌的转移。单细胞DHS分析的主要研究方法包括单细胞转座酶可及染色质测序(single-cell assay for transposase accessible chromatin using sequencing，scATAC-seq)[44]、单细胞DNA酶测序(single-cell DNase sequencing，scDNase-seq)和低输入 DNA酶I测序(low-input DNase I sequencing，liDNase-seq)等[45-46]。

染色质的几何结构与基因表达的调控、细胞核的组织(nuclear organization)、肿瘤的拷贝数变异以及肿瘤转移有关[47-48]。拓扑关联域(topologically associating domains，TAD)被认为是基因组的基本调控单位。TAD及其边界区域对于维持基因的正常功能至关重要，其破坏可引起功能异常。故对TAD的研究有利于更深入地理解异常发生的机制[49]。如Lupiáez等[50]发现罕见的手指合并ACRPV综合征(acropectorovertebral syndrome)是WNT6前方因倒位增加了邻近TAD中的一组肢体增强子所致的疾病。目前单细胞染色质拓扑学的研究技术有单细胞Hi-C(single-cell Hi-C，scHi-C)[51]、单细胞组合索引Hi-C(single-cell combinatorial indexed Hi-C，sciHi-C)以及单核Hi-C(single-nucleus Hi-C，snHi-C)等[52-53]。

1.2.4 单细胞转录组测序 单细胞RNA测序(single cell RNA sequencing，scRNA-seq)可以用于生物学和医学研究的多个方面，包括揭示胚胎的遗传程序、组织的细胞组成、基因表达的动力学和转录水平的差异性以及肿瘤的发展机制等[54]。如Xue等[55]通过scRNA-seq鉴定了人和小鼠早期胚胎中多态基因的阶段特异性单等位基因表达模式，扩展了对早期胚胎发育的基因激活顺序、转录特征以及遗传编程认识；Mahata等[56]利用Th2细胞的单细胞转录组学数据，鉴定了可作为生成类固醇的细胞亚群的生物标记Ly6c1/2；Shalek等[57]通过scRNA-seq分析经LPS处理的骨髓树突细胞，发现了某些基因表达和剪接的双峰模式(bimodal pattern)；Tirosh等[58]通过scRNA-seq分析早期少突胶质细胞瘤细胞的拷贝数变异，重建了未分化癌细胞的发育程序，首次在人类脑瘤样本中鉴定了肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)，证实了肿瘤干细胞模型。新近的单细胞RNA测序技术有索引液滴RNA测序(indexing droplets RNA sequencing，inDrop-seq)[59]、单细胞组合索引RNA测序(single-cell combinatorial indexing RNA sequencing，sci-RNA-seq)和基于分裂池连接的转录组测序(split-pool ligation-based transcriptome sequencing，SPLiT-seq)等[60-61]。

1.2.5 单细胞空间组测序 细胞的空间位置信息在谱系发育和一些肿瘤的相关研究中至关重要。如利用组织中的细胞位置信息可以跟踪胚胎发育过程中谱系分配和分化的空间模式；对于一些肿瘤如导管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)和浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma，IDC)，其组织病理的空间位置信息则是其分类的依据。虽然在某些情况下可以从scRNA-seq数据推断出空间参数，但这种计算推理有许多局限性，如Seurat方法依赖于原位杂交(insituhybridization，ISH)所确定的空间界标[23]，因而受ISH图谱低分辨特性的限制。因此，诸如Tomo-seq、Geo-seq、TSCS、FISSEQ等的直接空间转录组研究方法被相继研发[62-65]。如Casasent等[66]通过拓扑单细胞测序(topographic single cell sequencing，TSCS)，结合激光捕获显微切割(LCM)、激光弹射(laser catapulting)、全基因组扩增(WGA)和scDNA-seq，保留单个肿瘤细胞的空间信息的同时分析拷贝数畸变(copy number aberrations，CNAs)，推出了继独立谱系模型(independent lineage model)和进化瓶颈模型(evolutionary bottleneck model)之后的多克隆侵袭模型(multiclonal invasion model)。

2 多组学单细胞测序

2.1 多组学单细胞测序的定义

如图2所示，多组学单细胞测序是指将不同的组学测序联合起来或将同一组学的不同层次测序联合起来进行分析。一方面，由于技术噪音(technical noise)和固有噪音(intrinsic noise)的存在，单一组学测序方法具有效用限制性，因此一次性测量多种细胞特性的多组学单细胞测序可以更全面地表征细胞类型及其驱动因子[5]。另一方面，基因表达受到多个方面的调控，各个层次之间的相关性如何，是否存在起中枢作用的关键环节，疾病相关的变化发生在哪个时期等都是亟待解决的科研瓶颈。只有找到原因，才可为临床提供切实可靠的治疗指导。因此，对细胞的研究就需要从单组学拓展到多个组学的联合。

图2 多组学单细胞测序

2.2 多组学单细胞测序在生命科学研究领域的应用

目前多组学单细胞测序已经被用于神经科学、肿瘤研究以及免疫学等生命科学研究的多个领域。

DNA甲基化和核小体占据(nucleosome occupancy)属于表观修饰范畴，研究其深入机制至关重要。单细胞核小体占据和甲基化组测序(single cell nucleosome occupancy and methylome sequencing，scNOMe-Seq)可用于评估多能基因如OCT4和NANOG的核小体占据和DNA甲基化状态，You等[67]由此揭示了核小体缺失区域(NDR)在DNA从头甲基化和转录调控中的关键作用。

通过联合全基因组亚硫酸盐测序(whole genome bisulfite sequencing，WGBS)和scRNA-seq对人类单个原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)和诱导多能干细胞进行分析[68-69]，可研究细胞全能性和表观遗传重编程对可变剪接异质性调节的影响。整合scCOOL-seq和scRNA-seq对小鼠单个卵母细胞进行转录组[70]，DNA甲基化和染色质可及性分析可鉴定参与卵母细胞成熟的表观修饰和转录因子，剖析卵母细胞在发育和全能性建立中的表观遗传改变。将单细胞的基因组拷贝数变异、染色体状态/核小体定位、DNA甲基化、染色体倍性分析联合起来，通过染色质全组学景观测序(chromatin overall omic-scale landscape sequencing，COOL-seq)可鉴定小鼠受精卵着床前表观基因组重编程的关键特征和探索染色体状态与DNA甲基化两者的互动关系[71]，深入理解细胞多能性的表观遗传调控机制和异常胚胎的发育机制，为体细胞克隆效率的提高以及早期胚胎发育异常的诊断与治疗提供新思路。

大脑作为人体最复杂的器官，可通过联合snDrop-seq(single-nucleus droplet-based sequencing)和scTHS-seq(single-cell transposome hypersensitive site sequencing)获取其单个细胞核的转录组和DNA可及性图谱，用于研究如髓鞘再生等复杂的大脑生理遗传程序[72]。

恶性肿瘤作为常见的死因之一，对人类健康构成了严重威胁。肿瘤是体内外多种因素引起的细胞失控性增殖疾病。对肿瘤的单细胞测序探索现已涉及外显子组与基因组、转录组与基因组、表观组与转录组、转录组与蛋白组、蛋白组与代谢组、基因组与转录组及表观组等多种交叉组学。

通过全基因组和外显子组单细胞测序方法(whole-genome and exome single cell sequencing)对单个正常细胞、雌激素受体(ER)阳性细胞和三阴性细胞进行单核拷贝数分析[73]，可发现ER+肿瘤细胞在生长过程中高度保守，而三阴性肿瘤细胞的点突变率逐渐增加，从而演变形成肿瘤的克隆多样性，这对乳腺肿瘤的演变、化学耐药性的诊疗具有重大意义。

Reuter等[74]利用Simul-seq(simultaneous DNA and RNA sequencing)同时获取食道腺癌组织的全基因组和转录组测序数据，发现肿瘤细胞中的基因组呈现出高度的非整倍性和局部的等位基因纯合性，且特异等位基因的表达增加，由此鉴定了与治疗反应相关的基因多态性。

通过基于索引的单细胞染色质可及性与mRNA共测序(single-cell indexing-based coassay of chromatin accessibility and mRNA，sci-CAR)重建RNA谱定义的单个肺癌细胞的染色质可及性谱[75]，深入揭示顺式作用元件与染色体可及性之间的联系，对细胞之间调节异质性的探索提出了一个新的特征维度。

Darmanis等[76]和Genshaft等[77]联合mRNA的逆转录测序和PEA技术，分别对单个早期胶质母细胞瘤细胞和人类单个乳腺癌细胞进行干扰状态下的mRNA和蛋白质定量分析，逐步证实了异质mRNA和蛋白质表达的协同性。Younglee等[78]利用微孔技术量化原癌基因cMET在转录和翻译抑制剂调节作用下的mRNA和蛋白质表达情况，发现了非小细胞肺癌(NSCLC)的不同转录物-蛋白质相关模式，促进了与动态基因表达和蛋白质表达相关的研究从生命科学向更微观的细胞调节机制深入发展。

代谢物是特定细胞过程遗留下的特殊化学指纹。当其他组学数据分析无法解释细胞体内的生理活动时，对代谢物组的表征是个非常重要的补充。Xue等[79]利用代谢物的表面竞争性结合荧光读数原理将代谢物的检测整合到蛋白质测定的单细胞条形码芯片(single-cell barcode chip，SCBC)中，通过分析人单个胶母细胞瘤细胞对表皮生长因子受体拮抗剂的反应，首次揭示了细胞间代谢物的异质性和药物诱导的代谢物——磷蛋白相关网络的变化情况。

在表观组和基因组的基础上综合转录组，通过scTrio-seq(single-cell triple omics sequencing)可发现大规模拷贝数变异对基因组某些区域的DNA甲基化和RNA表达比例的影响[80]，用于鉴定人肝癌组织中的癌细胞新亚群，深入研究基因组和表观基因组异质性对细胞群内转录组异质性的影响。

人体依赖免疫系统识别“异己”，清除入侵的各种抗原或自身的异常细胞。George等[81]联合微流体和RNA测序对单个免疫细胞进行全转录组和分泌的蛋白并行检测，在小鼠的巨噬细胞中发现了与TNF-α分泌高度相关的基因亚组，促进了免疫系统调节机制的深入研究，以发掘药靶用于疾病的治疗。利用DNA条形码技术，转录组与表位细胞索引测序(cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing，CITE-seq)以及RNA表达与蛋白质测序(RNA expression and protein sequencing，REAP-seq)对外周血单核细胞和CD8+T细胞进行研究[82-83]，鉴定了仅转录组学无法区分的亚群以及异常细胞群与正常细胞差异表达的蛋白质，提示CITE-seq和REAP-seq未来可用于检测多种不同的免疫细胞，推动新型肿瘤免疫疗法的开发。Geiger等[84]通过高分辨率质谱技术(high-resolution mass spectrometry)获取人幼稚T细胞的动态代谢组和蛋白组图谱，发现了3种感受L-精氨酸水平的转录因子(BAZ1B、 PSIP1和TSN)及L-精氨酸水平对T细胞存活和抗肿瘤活性的影响，为研究细胞的代谢与功能之间复杂的相互作用开辟了新道路。

3 单细胞测序在口腔医学中的应用

环境中的生物膜被认为是致病生物的储存库。单细胞基因组学是捕获新基因组的方法之一，使用单细胞方法从环境中捕获基因组可用于病原体基因型和流行的相关研究。如Mclean等[85]利用单细胞基因组测序，首先通过FACS将从医院水槽的生物膜中获取的单个细菌细胞递送到微量滴定孔中，接着使用自动化平台裂解细胞并进行DNA扩增以创建单细胞基因组DNA文库，随后对16S rRNA基因进行循环测序以分析文库的多样性，然后挑选出目标基因组进行全基因组测序；最后使用专门的组装工具对所选基因组进行组装，获得了牙周病原体新的牙龈卟啉单胞菌株的完整基因组，为最终揭示它们在宿主和环境之间的传播模式提供了可借鉴的研究方向。

牙周炎是导致牙齿脱落的主要原因，且与许多系统性疾病包括糖尿病、心血管疾病以及骨质疏松症等有关[86-88], 但与其相关的微生物在疾病中的作用机制还未十分清楚。口腔中富含微生物，但许多菌群至今还未被培养出来，其相关研究也因此受限。如硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria，SRB)就是一类未培养的口腔微生物，许多研究发现其与牙周炎尤其是重症牙周炎相关[89-91]。利用单细胞基因组测序，可以研究未培养菌群的功能，探索其与牙周组织疾病及全身疾病的关系。如Campbell等[92]采用荧光原位杂交(FISH)和流式细胞分选相结合的方法，首先从样品中分离出δ变形菌属(Deltaproteobacteria)；然后利用MDA扩增单细胞基因组DNA；接着通过16S rRNA或SSU rRNA基因测序对单细胞扩增基因组(single cell amplified genomes，SAGs)进行分类以获得目标SRB菌属中脱硫叶菌(Desulfobulbus)和脱硫弧菌(Desulfovibrio)的基因组；最后将获得的基因组数据与其他δ变形菌的基因组进行比较，发现前两者存在与粘附、抗应激以及防御相关的特异基因，揭示了它们在牙周病病因学中的可能作用。

此外，利用单细胞基因组测序还可以揭示不同口腔微生物中疾病相关基因的进化过程，进而研究细菌与宿主间相互作用的深层机制。如坦纳菌福赛斯(Tannerellaforsythia)被认为与牙周炎、牙龈卟啉单胞菌及树突状螺旋体有关[93-94]，而与其亲缘关系最近的坦纳菌BU063(Tannerella BU063)本身却并不致病，被发现在健康的牙周环境中比在患病的牙周袋中更普遍。Beall等[95]对健康相关的坦纳菌BU063进行单细胞基因组测序：首先利用流式细胞术从健康受试者的龈下菌斑中分离出单个细胞；随后对其基因组进行扩增；接着对16S rRNA基因测序，然后在核心口腔16S基因数据库(CORE oral 16S gene database)中进行BLAST搜索以鉴定出所需的BU063，最后利用试剂盒制备其基因组文库，分析发现其与牙周病致病坦纳菌福赛斯之间存在基因组成上的差异，即在BU063中未发现福赛斯中已知的包括karilysin、prtH和bspA在内的毒力基因，故提出病原体的毒性可能源自致病性基因簇的存在的观点，为解释高度相似的口腔微生物间具有不同致病潜能的现象提供了新的研究思路。

肿瘤内的细胞异质性对肿瘤的生长、转移以及肿瘤对治疗的反应等肿瘤生物学的多个方面具有重要影响[96]。单细胞转录组测序(scRNA-seq)可以用于鉴定肿瘤的组成和癌症干细胞以及为肿瘤的耐药性提供新的见解。因此，口腔颌面部的肿瘤亦可利用scRNA-seq进行相关研究。如Puram等[97]对不同口腔鳞状细胞癌患者的肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞进行scRNA-seq分析，发现后两者在不同患者中的表达程序具有一致性，而肿瘤细胞在肿瘤之间及肿瘤内部则存在多方面的差异表达。在差异表达的程序中，研究人员结合上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition ，EMT)的特点，提出了肿瘤细胞的部分上皮-间质转化(partial EMT，p-EMT)概念，通过将scRNA-seq数据与头颈部鳞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)的常规大体测序数据进行整合比较，根据p-EMT细胞的特点重新把HNSCC亚型分为三类，并通过实验证明p-EMT可以作为淋巴结转移、淋巴结分期的独立预测因子，即p-EMT评分可以帮助预测淋巴结转移，从而避免不必要的颈部淋巴结清扫术，为更好地了解上皮性肿瘤的内部异质性与其侵袭性和转移的关系提供了实验支持以用于指导临床实践。

4 展 望

近十年来，单细胞测序技术方兴未艾，从细胞鉴定、谱系分析到伪时分析，随着单细胞技术的不断发展和成熟，单细胞测序在生理病理研究方面扮演越来越重要的角色。如口腔医学领域利用单细胞测序技术，打开了口腔微生物暗物质(microbial dark matter，MDM)研究的大门[98]，使口腔疾病的病因学研究向前迈出了重要的一步；将单细胞测序与肿瘤研究相关的方法引进口腔颌面部肿瘤的机制探索实验中，推动其迅猛发展。未来单细胞测序将持续由单组学向多组学延伸，通过整合数据，建立一个全面的人类细胞图谱[99]，揭示细胞功能的潜在机制并推断细胞之间的因果关系，最终解答诸如“什么是细胞类型”等重要的生物学问题。