番石榴叶总三萜改善糖尿病大鼠视网膜损伤的作用机制研究

张俏，罗影，刘学政

糖尿病病程延长可导致视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）凋亡甚至死亡，RGC 数量随之减少［1-2］。RGC轴突形成视神经，RGC损伤会影响患者的视力［3］。因此，保护RGC 免受损伤对防治糖尿病视网膜损伤尤为重要。近年来中医药在防治糖尿病中具有较好的效果［4-5］。番石榴叶总三萜（total triterpenoids in guava leaves，TTPGL）为番石榴叶的提取物，具有明显的降低血糖及抑制炎症反应的作用，对糖尿病的防治具有较好的疗效［6-7］。但TTPGL 对糖尿病视网膜损伤的影响目前尚不清楚。因此，本研究拟应用TTPGL 对糖尿病大鼠进行灌胃治疗，探讨TTPGL 对糖尿病视网膜损伤的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF 级雄性SD 大鼠60 只，体质量200～240 g，购自锦州医科大学实验动物中心（动物编号：0000455），常规饲养，环境温度20～25 ℃，湿度50%～70%。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma）；TTPGL 粉末（纯度为98%，大连美伦公司）；HE 染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；兔源神经胶质酸性蛋白（GFAP）、核转录因子（NF）-κB、肿瘤坏死因子（TNF）-α抗体（英国Abcam公司）；免疫荧光染色试剂盒、Western blot 二抗（PTG 公司）。荧光倒置显微镜（日本Olympus 公司）；冰冻切片机（德国SLEE 公司）；水平电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备 50 只大鼠按55 mg/kg 腹腔一次性注射STZ，72 h 后采尾静脉血测血糖，将血糖＞16.7 mmol/L的大鼠定为糖尿病模型［8-9］，建模成功率为100%。模型诱导成功后，大鼠编号并按照随机数字表法分成5组：糖尿病组（DM 组）、TTPGL 低剂量组（TTPGL-L 组，50 mg/kg）、TTPGL中剂量组（TTPGL-M组，100 mg/kg）、TTPGL高剂量组（TTPGL-H组，200 mg/kg）及二甲双胍组（Met组，10 mg/kg，阳性对照），另取10 只正常大鼠作为对照（CON）组。动物成模1 周后，每天上午8:00—10:00 以2 mL 无菌生理盐水溶解TTPGL后灌胃给药，每日1次，灌胃剂量依据文献［6-7］及预实验。CON组及DM组给予2 mL生理盐水，12周后进行各项指标检测。整个实验过程遵循国家《实验动物管理条例》相关规定。

1.2.2 样本制备 12周后，采集尾静脉血检测血糖水平。每组按随机数字表法取5只大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5 mL/kg）。4%多聚甲醛灌注固定后取出眼球，石蜡包埋切片，厚度为5 μm，常温保存，用于免疫荧光及HE 染色。每组另取5 只大鼠，以10%水合氯醛深度麻醉（7.0 mL/kg）处死后取视网膜，冰上剪碎裂解后静置30 min，4 ℃、12 000 r/min离心25 min，留上清。BCA法测蛋白浓度并制样，-20 ℃保存用于Western blot实验。

1.2.3 免疫荧光染色检测大鼠视网膜GFAP 表达 经1.2.2制备的切片脱蜡后浸于PBS洗涤3次，每次3 min；3%山羊血清+0.3%Triton-100室温孵育1 h；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP一抗（1∶300），4 ℃过夜；次日PBS 洗涤4 次，每次3 min；滴加荧光二抗，室温避光1 h；PBS洗涤4次，每次3 min；封片后荧光显微镜观察GFAP表达情况。

1.2.4 Western blot 检测NF-κB、TNF-α 蛋白表达 取1.2.2制备的上清，每孔上样50 μg 进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后半干法转膜（恒压20 V，18 min），1%BSA 室温封闭2 h。TBST 洗膜后NF-κB（1∶8 000）、TNF-α（1∶5 00）和内参β-actin（1∶20 000）一抗4 ℃杂交过夜。二抗室温摇床孵育2 h。ECL 试剂盒显色，Image J软件分析目的蛋白和内参灰度值并计算相对表达量。

1.2.5 HE染色检测RGC密度 经1.2.2制备的切片浸于PBS洗涤3次，每次3 min；滴加苏木素染色2 min；PBS浸泡1 min，自来水冲洗；95%乙醇1 min，伊红浸染2 min，自来水冲洗；脱水透明后封片，拍照后应用Image J 软件计数RGC 数量并转化成密度。

1.3 统计学方法 所有数据采用SPSS 20.0 统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用SNK-q检验进行多重比较，方差不齐时采用Games-Howell 法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠空腹血糖水平检测结果 分组干预12 周后，与CON 组相比，DM 组血糖明显升高（P＜0.05）；与DM组相比，TTPGL-M组、TTPGL-H组、Met组血糖依次降低（均P＜0.05），而DM组与TTPGL-L组差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 各组大鼠视网膜GFAP表达水平比较 将CON组GFAP 蛋白荧光强度设定为100%，与CON 组相比，DM 组GFAP 荧光强度明显升高（P＜0.05）；与DM 组相比，TTPGL-M 组、TTPGL-H 组、Met 组治疗后GFAP 表达依次降低（均P＜0.05），DM 组与TTPGL-L 组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、3。

Fig.1 Comparison of fasting blood glucose levels between six groups of rats图1 6组大鼠空腹血糖水平比较

Fig.2 The expression of GFAP in retina between the six groups of rats(immunofluorescent staining,×400)图2 6组大鼠视网膜GFAP的表达（免疫荧光染色，×400）

Fig.3 Comparison of GFAP expression in retina between six groups of rats图3 6组大鼠视网膜GFAP表达水平比较

2.3 各组大鼠视网膜NF-κB、TNF-α蛋白表达水平比较 与CON组相比，DM组NF-κB、TNF-α表达明显升高（P＜0.05）；与DM 组相比，TTPGL-M 组、TTPGL-H 组、Met 组NF-κB、TNF-α 表达依次降低（均P＜0.05），而DM组与TTPGL-L组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见图4、表1。

Fig.4 The relative expressions of NF-κB and TNF-α in retina between six groups图4 6组大鼠视网膜NF-κB、TNF-α蛋白表达水平

2.4 各组大鼠视网膜RGC 密度比较 与CON 组相比，DM组RGC密度明显下降（P＜0.05）；与DM组相比，TTPGL-M组、TTPGL-H组、Met组治疗后RGC密度依次增加（均P＜0.05），而DM组与TTPGL-L组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表1、图5。

Fig.5 Comparison of retinal RGC density between six groups of rats(HE staining,×400，bar=25 μm)图5 6组大鼠视网膜RGC密度比较（HE染色，×400，标尺=25 μm）

Tab.1 Comparison of relative expressions of NF-κB,TNF-α and RGC density of retina between six groups表1 6组大鼠视网膜NF-κB、TNF-α蛋白相对表达及RGC密度比较（n=5，±s）

Tab.1 Comparison of relative expressions of NF-κB,TNF-α and RGC density of retina between six groups表1 6组大鼠视网膜NF-κB、TNF-α蛋白相对表达及RGC密度比较（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a与CON 组比较，b与DM 组比较，c与TTPGL-L 组比较，d与TTPGL-M组比较，e与TTPGL-H组比较，P＜0.05

组别CON组DM组TTPGL-L组TTPGL-M组TTPGL-H组Met组F NF-κB蛋白相对表达量（%）4.16±0.23 22.43±1.76a 22.14±1.58a 12.04±1.02abc 10.17±0.97abcd 9.18±0.12abcde 438.194＊＊TNF-α蛋白相对表达量（%）6.24±0.35 24.17±1.53a 24.03±1.42a 8.58±0.12abc 6.34±0.09abcd 5.45±0.27abcde 552.128＊＊RGC密度（个/mm2）846.29±10.34 318.43±6.44a 322.09±6.17a 640.81±8.45abc 716.94±9.13abcd 835.72±10.86abcde 864.394＊＊

3 讨论

糖尿病视网膜损伤长期以来被认为是一种血管疾病，但针对血管病变的治疗并未取得满意效果。目前研究证实，DM患者的视觉功能障碍与神经病变损伤关系密切［10］。RGC 是目前研究最多的视网膜损伤的靶点，DM 状态下RGC 的丢失或损害是患者视力下降的重要原因［11-12］。本研究也证实，DM大鼠RGC密度明显降低。因此，有效抑制RGC损伤是防治DM视网膜损伤的重要靶点。

有文献报道TTPGL 可通过激活大鼠骨骼肌中的PI3K/AKT 信号传导及调节氧化应激水平，对STZ诱导的DM 大鼠产生保护作用［13］；同时TTPGL 还具有抗炎作用［7］。本实验采用低、中、高3 种剂量的TTPGL 对STZ 诱导的DM 大鼠进行灌胃治疗，发现中、高剂量的TTPGL 可有效降低大鼠的血糖，且RGC密度也随之增加，这说明TTPGL可能通过降低血糖保护受损的RGC。

GFAP为一种中间丝结构蛋白，在Müller细胞内的过度表达可损伤视网膜结构及功能［14］。本课题组前期研究发现，抑制DM状态下GFAP的表达可增加RGC 密度，保护受损的神经元［15］。本研究发现，正常大鼠GFAP少量表达于视网膜GCL层，但在DM组GFAP 表达明显上调，贯穿视网膜全层。中、高剂量的TTPGL 可明显抑制GFAP 的表达，进而保护受损的RGC。Liu 等［14］研究发现，DM 时，不仅会引起视网膜GFAP 表达的增加，同时也会诱发视网膜炎症反应，中药柚皮苷可有效抑制GFAP的表达，进而抑制NF-κB炎症通路，保护损伤的视网膜Müller细胞；而GFAP 也是炎症反应活动的标志物［16］。因此，本研究进一步对炎性指标进行了检测。

炎症反应是机体消除损伤因子或修复组织损伤的免疫防御过程，其与DM 的关系尤为密切。越来越多的证据表明DM状态下视网膜或玻璃体中多种神经炎性因子，包括NF-κB、TNF-α、白细胞介素（IL）-6等表达明显增加［17］。NF-κB、TNF-α、IL-6等细胞因子表达上调可启动炎性级联反应，进一步激活核转录因子，最终诱导视网膜神经细胞凋亡。本研究发现，DM 组NF-κB、TNF-α 表达明显上调，而中、高剂量的TTPGL 可明显下调NF-κB、TNF-α 的表达，这与以往的研究相一致［18］，提示TTPGL 可能通过抑制炎症反应进而增加RGC密度。

综上所述，DM状态下会引起RGC密度的降低，而应用TTPGL 治疗后，可明显增加RGC 密度，这可能与TTPGL降低血糖，下调视网膜GFAP的表达，抑制炎症反应有关。当然，DM视网膜损伤发病机制复杂，TTPGL对其治疗作用的相关机制仍需深入探讨。