白藜芦醇减轻脑创伤大鼠炎性反应及神经元凋亡

简 宇，代凌云，吴丰学

(荆州市中心医院 急诊科， 湖北 荆州 443000)

脑创伤(traumatic brain injury，TBI)是一种致残率及致死率极高的脑部疾病，患者常会出现非血肿性、迁延性昏迷或重度神经功能损伤，同时TBI往往还伴随继发性损伤，如神经炎性反应、线粒体功能障碍、DNA氧化损伤、DNA自身修复功能障碍及神经细胞凋亡等，进一步加重脑部组织损伤[1]。TBI患者治疗后仍有不同程度的后遗症，如运动障碍、偏瘫及认知下降等[2]，严重影响患者生活质量。白藜芦醇(resveratrol，RV)又称芪三酚，是多酚类化合物，其在脑缺血再灌注损伤中有一定的神经保护作用[3]。 RV还可调控Notch信号通路作用于宫颈癌[4]和肝损伤[5]等，但其是否可通过Notch信号通路保护TBI还不清楚。本文旨在研究RV对TBI大鼠神经的保护作用，并从Notch信号通路分析其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级、成年、雄性SD大鼠，6月龄，体质量180～220 g[北京信生元生物医学科技有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0027]。

1.1.2 试剂与仪器:白藜芦醇(Sigma Aidrich公司)；ELISA试剂盒(YAD公司)；Notch1、Hes1、含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3，caspase-3)、B细胞淋巴瘤蛋白 2(B cell lymphoma 2，Bcl-2)及Bcl-2 相关蛋白(Bcl-2 assaciated X protein，Bax)一抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：采用液压打击法[6]构建颅脑创伤大鼠模型，将大鼠分为对照组、模型组、白藜芦醇低、中和高剂量组(舌下静脉分别注射5、10和20 mg/kg RV[7])，每组8只。

1.2.2 Morris水迷宫检测大鼠学习和记忆能力：待大鼠适应环境并学习游泳后，进行Morris水迷宫测试；将安全岛依次放入水迷宫内，再加入混有牛奶的水(牛奶∶水=2∶1，温度约22 ℃)，漫过安全岛约2 cm；随机从4个象限中放入大鼠，记录大鼠搜索安全岛潜伏期和游泳轨迹。

1.2.3 HE染色病理检测：取出脑组织(切除额叶、小脑部分，保留中间组织)固定于多聚甲醛过夜，进行常规石蜡包埋切片操作及苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察大鼠海马区神经元形态。

1.2.4 TUNEL染色检测神经元凋亡：参照上述方法制备脑组织切片，滴加3% H2O2反应10 min；加入蛋白酶，37 ℃孵育10 min，再加入标记液，37 ℃孵育2 h；加入封闭液，室温下反应30 min；加入生物素化抗地高辛抗体，37 ℃反应30 min；滴加链酶亲和素-过氧化物酶(SABC)液，37 ℃反应30 min；添加二氨基苯联安(DAB)显色，经苏木精复染，脱水、透明、封片，显微镜观察神经元凋亡数(细胞核中有棕黄色颗粒)，计算凋亡指数(凋亡细胞数/细胞总数×100%)。

1.2.5 ELISA检测炎性因子的含量：大鼠脑组织加入0.9%氯化钠溶液冰上匀浆，按ELISA试剂盒说明书，检测脑组织中炎性因子白介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的含量。

1.2.6 Western blot检测脑组织中相关蛋白的表达：在液氮中研磨脑组织成粉末，添加RIPA裂解液提取样本中总蛋白，检测蛋白浓度；取50 μg左右蛋白进行凝胶电泳，SDS-PAGE凝胶浓度为10%；待溴酚蓝达到分离胶底部时，切割凝胶至合适大小，进行电转；90 min后取出PVDF膜，孵育封闭液、一抗及二抗，进行免疫反应；最后采用全自动凝胶成像仪检测蛋白条带，并计算Notch1、Hes1、caspase-3、Bcl-2及Bax等蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 白藜芦醇对脑创伤大鼠学习和记忆力的影响

与对照组相比，TBI组大鼠运动轨迹、搜索安全岛潜伏期明显增加(P<0.05)；与模型组相比，RV 3个剂量组运动轨迹、搜索安全岛潜伏期呈浓度依赖性明显缩短(P<0.05)(图1)。

2.2 白藜芦醇对脑创伤大鼠海马区损伤的影响

TBI模型大鼠海马CA1区表现为神经元数量减少，细胞排列紊乱，且出现明显的皱缩，胞质染色增强；与模型组相比，RV 3个剂量组CA1区明显减轻(图2)。

图2 白藜芦醇对脑创伤大鼠海马区(CA1)损伤的影响Fig 2 Effects of RV on hippocampus (CA1) injury in TBI rats(×40)

2.3 白藜芦醇对脑创伤大鼠神经细胞凋亡的影响

与对照组相比，TBI组神经元凋亡指数、脑组织中caspase-3的表达显著上调，Bcl-2/Bax水平显著下调(P<0.05)；与TBI组相比，RV 3个剂量组细胞凋亡指数、脑组织中caspase-3的表达显著下调，Bcl-2/Bax水平呈剂量依赖显著上调(P<0.05)(图3)。

A.effects of resveratrol on neuron apoptosis index in TBI rats; B.effects of resveratrol on the expression of apoptosis proteins in brain tissues of TBI rats; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TBI

2.4 白藜芦醇对脑创伤大鼠脑组织炎性因子水平的影响

与对照组相比，TBI组脑组织中IL-6、TNF-α及IL-1β水平显著上调(P<0.05)；与TBI组相比，RV低、中、高剂量组IL-6、TNF-α及IL-1β水平呈剂量依赖性显著下调(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TBI图4 白藜芦醇对脑创伤大鼠脑组织炎性因子水平的影响Fig 4 Effects of RV onlevels of inflammatory factors inbrain tissue of TBI

2.5 白藜芦醇对脑创伤大鼠脑组织Notch及Hes1蛋白表达的影响

与对照组相比，TBI组脑组织中Notch1和Hes1水平显著上调(P<0.05)；与TBI组相比，RV低、中、高剂量组Notch1和Hes1水平呈剂量依赖性显著下调(P<0.05)(图5)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with TBI图5 白藜芦醇对脑创伤大鼠脑组织Notch及Hes1蛋白表达的影响Fig 5 Effects of RV on expression of Notch and Hes1 protein inbrain tissue of TBI

3 讨论

常见的TBI动物模型大多为闭合性脑创伤[8]，本研究采用液压打击法处理大鼠，导致TBI大鼠海马CA1区出现明显的损伤，表现为神经元数量减少，细胞排列紊乱，明显皱缩及胞质染色增强；且TBI组大鼠运动轨迹及搜索安全岛潜伏期明显延长，表明成功复制TBI模型。RV广泛存在于花生、葡萄和桑椹等植物中，具有抗肿瘤、抗感染和抗氧化等作用，可保护心血管系统及神经系统等[9]。本研究发现RV可明显减轻大鼠海马CA1区损伤，神经细胞量增多，明显恢复胞核固缩；RV组大鼠运动轨迹及搜索安全岛潜伏期较TBI组明显缩短，提示RV对于TBI大鼠神经损伤具有一定的保护作用，与文献报道[10]相似。

Caspase-3、Bcl-2及Bax是细胞凋亡途径中的关键蛋白，caspase-3是凋亡的主要执行者，其激活后将直接切割细胞中的生命大分子；而Bcl-2可减少氧自由基、脂质过氧化物及多种细胞毒性因子的形成，而具有抗凋亡作用，Bax具有促凋亡作用，细胞内Bcl-2/Bax水平可以反映凋亡情况[11-12]。本实验结果显示，TBI可诱导大鼠神经元的凋亡，而RV可以抑制caspase-3的表达，并上调Bcl-2/Bax水平，抑制TBI大鼠神经元的凋亡。

神经炎性反应是TBI继发性损伤的重要病理基础之一，脑外伤后，小胶质细胞会募集白细胞，释放多种炎性因子，如IL-6、TNF-α及IL-1β等，产生级联反应放大炎症信号，破坏血脑屏障和线粒体功能，进而产生氧化损伤，加剧神经的坏死和功能障碍[13]。本研究发现，RV组大鼠脑组织中IL-6、TNF-α及IL-1β水平显著下调，表明RV可能通过减轻TBI大鼠神经炎性反应，发挥神经保护作用。

Notch信号通路在细胞结构和功能的发育中具有重要作用，而且参与调控组织和器官受损后的修复[14]。Notch信号通路的激活会增加神经细胞的易损性，引起脑功能障碍[15]。本研究发现，RV预处理后，脑组织中Notch1和Hes1的表达呈剂量依赖性下调，提示RV可能通过抑制Notch信号通路，而保护TBI大鼠脑损伤。

综上所述，白藜芦醇可保护大鼠神经损伤，改善其学习和记忆功能，抑制神经元的凋亡，并减轻大鼠炎性反应，可能与下调Notch1和Hes1的表达有关。