环状RNA在头颈部肿瘤侵袭转移中的研究进展*

吴丽媚 张焱 何子蕊 聂诗情 陈文慧

头颈部肿瘤（head and neck cancer，HNC）是全球高发肿瘤之一，在全球癌症常见死亡原因中排名第6位［1］。其包括鼻咽癌、喉癌、下咽癌、食管癌、口咽癌、甲状腺癌、牙龈癌、腮腺癌等。病理类型包括鳞状细胞癌、腺癌、腺样囊性癌、淋巴上皮癌、基底细胞癌、黏液表皮样癌等，其中以鳞状细胞癌最常见，占95%［2］。HNC主要的治疗措施包括外科手术、放疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗。然而，HNC深入的解剖位置、狭隘的空间、复杂精细的结构特点导致外科手术的难度大、放疗不良反应多。目前在治疗上，大多数临床医生比较关注局部控制率和生存率，可能忽略了远处转移率与死亡率的密切关系。据统计，HNC患者中死于远处转移有15%～20%，而所有HNC患者中实际上发生肿瘤远处转移的病例数是临床报道的3～4倍［3-4］，可见远处转移是影响HNC患者生存率的重要因素之一。

恶性肿瘤的侵袭和转移是在多种生物因素相互作用下，肿瘤细胞从原发部位释放，穿透基底膜，经过淋巴管或血液系统抵达远处部位［5］。寻找与肿瘤发生发展、侵袭转移有关的关键基因，进行针对性的靶向治疗是目前热门的肿瘤治疗手段之一，如EGFR、K-RAS、N-RAS、B-RAF、PI3K、TP53、BRCA1、BRCA2 等基因已被证明在肿瘤中发生突变［6-10］。针对性的靶向药物已成熟用于临床并取得一定的成效，如伊马替尼、索拉非尼、达拉非尼、吉非替尼、奥拉帕利等。除以上基因靶点之外，其他基因产物在肿瘤侵袭转移过程中发挥何种效果值得探讨。

最开始，人们认为以反向剪接方式形成的单链共价闭合的环状RNA在生物发生发展中只是一种异常剪接的“垃圾”［11］，但随着高通量RNA 测序技术（RNA-seq）和circRNA（exonic circRNA）特异性生物信息学算法的发展，人类对部分环状RNA 的了解越来越清楚［12］。已有研究报道，多数环状RNA 具有不同生物学功能，在基因完整、保守表达的过程中可能发挥调控作用［12］，部分环状RNA 被证明与多种人类疾病的生理和病理过程有关，如阿尔茨海默病［13］、帕金森病［14］、肿瘤的发生发展［15-16］等。环状RNA 可通过体液被检测，如唾液、血液和尿液中低浓度也可被找到［17-19］，其在体液中稳定性好，且灵敏度高。液体活检避免了有创活检对患者带来的伤害，具有方便易取且价格低廉等优点，更容易让患者接受。因此，从环状RNA 的角度来研究肿瘤侵袭和转移的机制、挖掘环状RNA作为肿瘤的分子靶向治疗具有重要的科学价值。本综述总结目前环状RNA在头颈部恶性肿瘤的侵袭转移中的研究进展，探寻更多临床诊断、治疗的可行方案。

1 环状RNA的产生和生物功能

环状RNA与传统的线性RNA不同，是共价封闭的从头至尾闭合成环的反向剪接形成［12-20］，来自上游和下游区域的序列以相反的方向连接在一起，没有5′-3′极性、5′帽和3′聚腺苷酸尾，所以比线性RNA更稳定，不容易被RNA外切酶或RNaseR（核糖核酸酶R）降解［20］。环状RNA的表达具有组织和阶段特异性［12］，并且可以被靶细胞摄取，在体液中可找到其表达［17-19］。3种环状RNA（图1）［21-22］由Pre-mRNA（premessenger RNA，前信使RNA）通过不同的循环机制产生，ecircRNA和EIciRNA均可由依赖剪接体的套索驱动环化、内含子配对驱动环化、RNA结合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）诱导驱动环化得到，ciRNA由内含子配对驱动环化形成。环状RNA在形成过程中特定序列是保守的，暗示其在生物的生存发展中具有生物学意义，一旦发生异常，可能导致机体发生一定的改变，这一生物学特征为其生物学功能提供保证。

图1 3种环状RNA

1.1 作为竞争的内源性RNA或微核糖核酸（microRNA，miRNA）海绵

研究表明，EcircRNA 可以与miRNA 上的特异靶点结合，通过充当miRNA 海绵来调节miRNA 的活性。miRNA 作为基因表达的重要转录后调节因子，可以直接通过碱基互补配对结合靶向mRNA（messenger RNA，信使核糖核酸）的非编码区。因此环状RNA可通过充当miRNA海绵而增加或降低下游基因的表达，在不同肿瘤中发挥抑癌或致癌的作用（表1）。CIRS-7/CDR1as 是第1 个被报道抑制miR-7 活性的miRNA海绵。Hansen等［23］通过一系列实验证明CIRS-7（miR-7 的环状RNA 海绵）含有70 多个miRNA靶位点，且CIRS-7中的miR-7位点能够促进特定的miR-7-AGO2（Argonaute2 蛋白）相互作用，从而抑制miR-7活性，导致miR-7的靶基因水平增加。同一个环状RNA 可以作为不同的miRNA 的海绵，发挥抑癌或致癌的作用。circ-HIPK3是miR-124的海绵，抑制miR-124的活性，上调miR-124靶基因Aquaporin3的水通道蛋白3（aquaporins 3，AQP3）的表达，从而促进肝癌细胞的增殖、迁移［28］。而circ-HIPK3 除了作为miR-124 海绵发挥致癌作用之外，还可以作为miR-558海绵，下调膀胱癌细胞中乙酰肝素酶（heparitinase，HPSE）的表达，抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭［29］。但是，并非所有的环状RNA 对miRNA 的调控都是通过“miRNA海绵”这一经典功能来调控miRNA的稳定性的。雄激素受体（androgen receptor，AR）通过在转录水平上调节其宿主基因（HIAT1）的表达来抑制circ-HIAT1 的表达，而circ-HIAT1 的下调导致miR-195-5p/29a-3p/29c-3p 表达下调，使cdc42 表达增加，从而增强肾透明细胞癌细胞的迁移和侵袭［30］。circ-HIAT1 提高了miR-195-5p/29a-3p/29c-3p 的稳定性，起到“miRNAs reservoir”的作用。目前环状RNA 通过作为miRNA 海绵，在基因表达调控中发挥关键作用，这一发现得到广泛认可和证实，为以环状RNA和（或）miRNA作为切入点进行肿瘤的临床诊断及靶点治疗提供有效的科学依据。

表1 环状RNA在不同肿瘤中充当miRNA海绵的功能

1.2 蛋白质翻译

大多数环状RNA由编码区的外显子组成，且大多数定位于细胞质，由此猜测环状RNA有翻译蛋白质的功能。由于环状RNA缺乏帽依赖性翻译所需要的元件—5′m7G帽和3′多聚A尾，故环状RNA不能通过传统线性RNA的帽依赖性翻译模式来进行蛋白质的翻译。但是，环状RNA可以依赖内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）来结合核糖体［42］，或者在5′非翻译区（untranslated region，UTR）进行N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰之后［43］，启动蛋白质的翻译。有研究证明，即使没有任何IRES序列、5′帽或3′多聚A尾结构，环状RNA也可以通过滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）机制有效地翻译［44］。由此，可概括出环状RNA进行翻译所需要的元件为开放阅读框（open reading frame，ORF）、IRES或带有m6A序列。目前得到充分证实的可以作为蛋白质模板的环状RNA有5个，分别是circ-SHPRH［42］、circ-PINT［45］、circ-FBXW7［46］、circ-Mbl［47］、circ-ZNF609［48］。circ-SHPRH［SNF2组蛋白连接物—PDH环解旋酶（PDH ring helicase，SHPRH）基因］使用与宿主基因重叠的遗传密码翻译出的一种新的蛋白质—SHPRH-146aa。SHPRH-146aa可以保护SHPRH免受泛素蛋白酶体的降解。稳定的SHPRH可通过泛素化增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作为E3连接酶来抑制细胞增殖，从而发挥抑癌作用。因此，SHPRH-146aa降低人胶质母细胞瘤细胞在体内外的恶性行为和致瘤性［42］。circ-PINT RNA的翻译产物PINT87aa通过与聚合酶Ⅱ相关因子1同源复合物（polymerase-associated factor 1，PAF1）结合，增加PAF1复合体与靶启动子的亲和力，从而阻止了CPEB1、SOX-2和MYC102等癌基因的表达，发挥抑癌作用［45］。circ-FBXW7编码的蛋白质FBXW7-185aa在胶质母细胞瘤中上调，通过竞争性与泛素化酶28（ubiquitinspecific proteins 28，USP28）结合，拮抗USP28诱导的c-Myc基因的稳定，从而抑制癌细胞的增殖，发挥抑癌作用［46］。另外，circ-Mbl和circ-ZNF609分别被Pamudurti等［47］、Legnini等［48］证明能以不依赖帽子结构的方式翻译成蛋白质。环状RNA的翻译产物是否与宿主线性RNA的蛋白质产物调节相同的生物过程，有待进一步证实。这一生物学功能挑战了以往人们认为只有mRNA才具有翻译功能的权威，为分子生物学领域开拓一个新的研究方向。

1.3 环状RNA-蛋白质相互作用

有些环状RNA 中存在蛋白结合序列，环状RNA与蛋白质之间发生相互作用，二者之间相互作用的具体机制未被充分报道，但是通过RNA pull down 实验、RNA 免疫沉淀实验、环状RNA 测序、激光共聚焦显微镜分析环状RNA 和蛋白质的共定位等实验方法［49-50］可以得到证实。环状RNA 既可以在细胞质中，也可以在细胞核中与蛋白质结合。报道得最多是ecircRNA，如circ-FOXO3［49］、circ-Amotl1［50］，ciRNA和ElciRNA 的报道相对较少。circ-FOXO3 可以与细胞周期素依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）和P21 蛋白结合形成circ-FOXO3-CDK2-P21复合物。CDK2属于细胞周期蛋白依赖性激酶家族，是细胞G1 期向S 期转变的必需物质，该复合物消耗了CDK2，阻止细胞由G1 期进入S 期。环状RNA 可以作为蛋白转运体，促使功能蛋白从细胞质转运到细胞核中，也可以作为功能蛋白的“储存库”，抑制这些蛋白的生物功能。如circ-Amotl1 可以与PDK1 和AKT1、STAT3和c-Myc结合，并促进其从细胞质和细胞核发生转移［50］。Ashwal-Fluss 等［51］发现MBL 蛋白与circ-Mbl 存在相互作用，MBL 基因中内含子、外显子的环化率依赖于MBL 蛋白水平，且当MBL 蛋白质表达升高，可通过促进circ-Mbl的产生来减少其自身mRNA的产生，而过量的MBL蛋白可被circ-Mbl结合吸收。环状RNA与蛋白质的相互作用作为一个新的科学视角，可进一步应用到肿瘤的诊断与治疗中。

1.4 调节选择性剪接或转录

环状RNA 有调节母本基因的转录调控，并且与经典的线性剪接有竞争关系。ciRNA没有外显子，故无法如ecircRNA作为miRNA海绵而进行基因表达的转录调控。但是ciRNA 可以通过调节RNA 聚合酶（RNA PolⅡ），以顺式作用的方式调节宿主转录活性，从而增强母本基因的表达［52］。circ-Mbl来自剪接因子MBL，其本身具有MBL 结合位点且能与MBL 特异地结合，MBL 水平的调节显著影响circ-Mbl 的形成，circ-Mbl与MBL的premRNA存在剪接竞争［51］。

2 环状RNA与HNC的侵袭转移

肿瘤的侵袭转移涉及复杂的分子机制，早前已有大量针对LncRNA 和microRNAs（miRNAs）在HNC侵袭转移中的调控网络的研究。近年来，随着环状RNA相关研究技术的逐渐成熟，环状RNA在HNC中的研究成为新的热点，对环状RNA 在HNC 侵袭转移中的机制的研究越来越多。

2.1 环状RNA与鼻咽癌

目前对于环状RNA 在鼻咽癌中的细胞增殖、侵袭、转移机制研究方向主要是“环状RNA 海绵miRNA，上调下游靶基因”途径。Zhang等［52］的研究发现，circ-ZNF609 可以与microRNA-150-5p 相互作用来促进鼻咽癌的生长和转移。该研究circ-ZNF609 和Sp1 在鼻咽癌组织中的表达水平明显高于正常鼻咽上皮组织，而microRNA-150-5p 在鼻咽癌组织中的表达明显降低，且circ-ZNF609 与Sp1 竞争性与microRNA-150-5p 结合。双变量分析显示，circ-ZNF609 与Sp1 呈正相关，而与microRNA-150-5p 呈负相关，已知Sp1是一种致癌基因，Sp1的高表达与肿瘤的转移及不良预后有关［53-54］。而Sp1是microRNA-150-5p 的靶基因，可被后者降解。由此可知circ-ZNF609通过竞争性海绵microRNA-150-5p，降低Sp1的降解，从而增强鼻咽癌细胞的增殖及转移能力，circ-ZNF609 在鼻咽癌中发挥致癌作用［55］。类似地，Zhong等［32］发现circ-CDR1as在鼻咽癌组织和细胞系中高表达，且circ-CDR1as的高表达与鼻咽癌临床分期相关、高生存率相关。内源性抑癌基因miR-7-5p是鼻咽癌CDR1as 的靶基因，E2F 转录因子3（E2F3）是鼻咽癌细胞miR-7-5p的靶基因，E2F3来自E2F转录因子家族，其可以通过加速葡萄糖代谢来促进肿瘤细胞的生长，E2F3 参与调节细胞增殖和细胞周期。因此，circ-CDR1 通过竞争性结合而抑制miR-7-5p，上调E2F3在鼻咽癌中的表达，从而促进肿瘤细胞的增殖。circ-HIPK3 具有miR-4288 结合位点，circ-HIPK3 通过海绵功能抑制miR-4288 的表达水平，从而增强ELF3的表达，促进鼻咽癌细胞的恶性发展［33］。EBV编码的circ-RPMS1可通过海绵多个miRNA 来促进鼻咽癌细胞的上皮-间质转化，从而促进肿瘤的侵袭转移［55］。除此之外，还有研究者证明，Rho相关激酶1（Rho associated kinase 1，ROCK1）是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞运动、肿瘤转移和上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）等多种生物学过程［56］，鼻咽癌组织中高表达的circRNA-LARP4 抑制ROCK1 的表达，从而抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭［57］。

2.2 环状RNA与喉癌

目前报道的关于环状RNA在喉癌的侵袭转移中的作用的研究见表2。研究证实，Hsa_circ_0042666在喉癌组织中可通过充当miRNA海绵，与miR223竞争性结合，降低靶基因TGFBR3在喉鳞状细胞癌组织中的表达，而TGFBR3基因具有抑制喉鳞状细胞体外侵袭的能力，故喉鳞癌组织中Has_circ_0042666的下调通过miR223/TGFBR3轴使靶基因的表达上调，发挥抑癌作用［58］。Lu等［67］通过对喉癌样本进行测序分析表明，与正常喉组织相比，喉鳞状细胞癌组织中29个环状RNA表达上调，19个环状RNA表达下调，其还预测了几个与癌症相关的miRNAs的相互作用，并且京都基因与基因组百科全书（Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析表明，PPAR、Axon导向、Wnt和细胞周期信号通路是LSCC过程中的关键信号通路。环状RNA是否与其他信号通路相互作用或是否以其他生物学功能在喉癌的侵袭转移中发挥关键作用，值得进一步深入研究证明。

表2 与喉癌侵袭转移有关的环状RNA

2.3 环状RNA与食管癌

越来越多的证据表明，环状RNA 在食管癌的侵袭、转移中起到重要作用。作为拥有70 多个miRNA结合位点的环状RNA，cirs-7在食管癌中通过海绵不同的miRNA 来促进肿瘤细胞的恶性行为。CIRS-7通过海绵miR-876-5p 来增强MAGE-A 家族的表达［34］，通过调节海绵miR-7 来增强HOXB13 介导的NF-κB/p65 通路［35］，通过调节miR-7/KLF4 轴和激活NF-κB/p65 信号来促进发食管鳞癌细胞的迁移和侵袭［36］。另外，circ-VRK1 作为miR-624-3p 的分子海绵，可改善PTEN的表达，而降低PI3K/AKT 信号通路的活性来抑制食管鳞癌的进展［37］。除了以“海绵miRNA”的方式之外，circ-GSK3β可以直接抑制其亲本蛋白GSK3β 的生物发生，从而抑制Wnt/β-catenin介导通路来促进食管鳞癌细胞的转移［15］。Zhang等［68］以实验证明，敲除circ-Smad7可以促进食管癌细胞的增殖和迁移，而高表达的circ-Smad7则起到了相反的作用，但该研究未对circ-SMAD7 对食管鳞癌的确切作用机制阐述，需要进一步的实验来探索。

2.4 环状RNA与甲状腺癌

远处转移同样是甲状腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）治疗效果欠佳的原因之一。与鼻咽癌、喉癌、食管癌类似，环状RNA 可通过“海绵RNA”影响PTC 的 发生 发 展。研 究 证明［38］，circ-ICTH 海 绵miR22-3p 使细胞核中β-catenin 的E3 连接酶（E3 ligase of nuclear β-catenin，CBL）的表达增多，CBL抑制了Wnt/β-catenin 通路的激活，从而减缓PTC 的进展。类似地，circ-NEK6 以激活circ-NEK6/mir-370-3p/Wnt 信号通路来抑制PTC 的发展［39］，circ-ZFR 通过调节miR-1261/C8orf4 轴在PTC 中发挥致癌作用［40］，Has_circ_0004458 通过抑制miR-885-5p/Rac1轴来参与PTC的进展［41］。

2.5 环状RNA与其他HNC

目前，环状RNA在其他HNC，如咽癌、口咽癌、牙龈癌、腮腺癌等中的研究远不如前面的几个肿瘤，可能与其发生率低有关，但对于环状RNA在其发生、侵袭中的作用不容忽视。

3 结语

随着环状RNA的生物学特征和生物学功能逐渐被证实，环状RNA 在疾病诊断及治疗等方面的潜力日渐获得重视。环状RNA因其高稳定性和组织特异性，优越性明显高于miRNA和lncRNA。环状RNA已被证明在各种肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移中发挥重要作用，具备作为生物标志物和治疗靶点的能力。对环状RNA的深入了解和充分利用将会在临床大放异彩。本综述总结了环状RNA 生物特征、生物学功能、以及目前环状RNA 在HNC 的细胞增殖、侵袭、转移中的主要研究方向。环状RNA 在HNC 的侵袭、转移机制中的研究相对单调，主要以“环状RNA海绵miRNA，上调下游靶基因”途径为主。纵观环状RNA在其他肿瘤的研究方向、方法，我们可以借鉴、学习，从而深入发掘环状RNA 的蛋白质翻译、调节选择性剪接或转录、与蛋白质相互作用等生物学功能在HNC的恶性行为中更多的可能性。环状RNA可以从血液、尿液、唾液等方便易取的标本中获得。继续深入探索环状RNA与肿瘤侵袭转移的“亲密”关系，把从血液、尿液、唾液等体液中检测环状RNA 的表达量作为肿瘤患者规范治疗后的定期复查指标，能较大程度上增加复查的精确性、减轻患者的医疗费用、提高患者的依从性。环状RNA 在肿瘤的诊治中蕴含巨大的潜力，准确把握其在肿瘤中的关键靶点作用，积极深入探索并应用到临床上。