高效液相色谱法测定带药骨水泥中硫酸庆大霉素C 组分的含量

李沅，马金竹（通信作者），王翔宇

天津市医疗器械质量监督检验中心 （天津 300384）

骨水泥的主要成分为聚甲基丙烯酸甲酯，使用前分为粉末状骨水泥聚合体和水剂的甲基丙烯酸甲酯，将两者进行调和，5～10 min 后聚合成粘性物质。骨水泥在髋膝关节手术中起到固定的作用，为控制关节局部感染，还可使用抗生素类骨水泥。自1970年Buchholz、Engelreecht 等首次将抗生素骨水泥尝试应用于控制关节感染以来，人们开始认识到这种局部给药系统的优点，并将其广泛应用于预防和治疗骨科相关感染，尤其是对假体周围感染的治疗取得了很好的效果。

在骨水泥的实际临床应用中，选择合理的抗生素是首要问题。目前，应用较多的是庆大霉素、妥布霉素等，其具有抗菌谱广、耐热稳定性好、吸收迅速等优点。我们通过对骨水泥中硫酸庆大霉素含量的准确测定，可以对带药骨水泥粉体原料、生产搅拌工艺及成品进行质量控制，为临床应用提供技术支持。

本试验参考药典[1]，并在大量试验的基础上建立了测定骨水泥中硫酸庆大霉素C 组分含量的高效液相色谱法，该方法具有操作简单、重现性及稳定性好的优势，为保证该类产品的质量提供了有价值的质量控制方案。

1 仪器与试药

1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司），紫外检测器，G1316A 型色谱工作站；带药骨水泥（深圳市汉强医用材料有限公司），乙腈（为色谱纯，天津渤化化学试剂有限公司），氯甲酸-9-芴基甲酯（Fmoc-Cl） （为分析纯，SIGMA），甘氨酸（为分析纯，SIGMA），硼砂（Na2B4O7·10H2O） （为分析纯，SIGMA），氢氧化钠（为分析纯，天津渤化化学试剂有限公司），硫酸庆大霉素工作标准品（MACKLIN），硫酸新霉素工作标准品（MACKLIN）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×100 mm，4 μm），流动相为乙腈:水（95:5），流速为1.0 ml/min，进样体积为20 μl，柱温为25 ℃，紫外检测器的检测波长设置为265 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 供试品溶液

准确称取1.50 g 骨水泥粉体，倒入250 ml 碘量瓶中并加入250.0 g 纯化水，然后加入磁性转子，盖上瓶盖，在磁力搅拌台上高速搅拌30 min，取10 ml 悬浮液在4 000 rmp 的条件下离心6 min，上清液用纯化水稀释4倍，待测。

2.2.2 对照品溶液及标准工作液

精密称取硫酸庆大霉素20.0 mg 于小烧杯中，加入适量纯化水，搅拌至充分溶解，转移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，配置成2 mg/ml 的母液。

分别精密量取15、50、125、250、500 μl 硫酸庆大霉素母液于10 ml 容量瓶中，流动相定容至刻度，混匀，配置成浓度为3.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml 的对照品标准工作液。

2.2.3 新霉素内标液

准确称取50 mg 硫酸新霉素于小烧杯中，加入适量纯化水，搅拌至充分溶解，转移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，配置成浓度为5 mg/ml 的母液，使用时，将母液用纯化水稀释5倍，配置成工作液。母液和工作液均保存于-20 ℃冰箱中。

2.2.4 一般试剂

（1）0.2 mol/L 硼砂缓冲液（pH=8.0）：称取1.24 g 硼酸（H3BO3）溶于70 ml 纯化水中，使用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至8.0，最后用纯化水定容至100 ml 容量瓶中，混匀。（2）8 mmol/L Fmoc-Cl 衍生化试剂：称取207 mg Fmoc-Cl（摩尔质量为258.7 g/mol）于小烧杯中，加入适量乙腈搅拌溶解，转移至100 ml 容量瓶中，乙腈定容至刻度，混匀，于4 ℃环境中避光保存。（3）0.1 mol/L 甘氨酸溶液：称取75.07 mg 甘氨酸（摩尔质量为75.07 g/mol）于小烧杯中，加入适量纯化水搅拌溶解，转移至10 ml 容量瓶中，定容至刻度，混匀，于4 ℃环境中避光保存。

2.2.5 衍生化处理

准确移取100 μl含硫酸庆大霉素的供试品溶液，依次向其中加入5 μl硫酸新霉素内标液（1 g/L）、100 μl乙腈、100 μl硼砂缓冲液（0.2 mol/L，pH=8.0）、100 μl Fmoc-Cl衍生化试剂（8 mmol/L），旋涡混匀30 s，置于暗处反应15 min后，再加入20 μl甘氨酸（0.1 mol/L），旋涡混匀30 s，反应结束；此外，将标准工作液同样进行上述衍生化处理。

2.3 方法适用性试验

依据给定的色谱条件，分别取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液，依次进样，记录色谱图，见图1～3。硫酸庆大霉素4个组分峰的出峰时间在6～8 min，第1个峰与第2个峰分离度为2.1，第2个峰的理论塔板数为5 338。

2.4 线性关系

取“2.2.5”衍生化处理后的待测液，用0.22 μm 或0.45 μm 的滤头过滤，按照给定的色谱条件进行测定，记录内标物及各浓度目标物的色谱峰面积，以目标物与内标物峰面积比（Y）对溶液浓度（X）作标准曲线，求得硫酸庆大霉素4个峰的回归方程和R2值（表1）。在3～100 μg/ml 范围内，目标物与内标物峰面积比与目标物浓度呈良好的线性关系。

2.5 重复性试验

取同一批样品，按照“2.2.1”和“2.2.5”项下方法平行配制6份待测液，依次进样，记录结果并计算含量，6次结果的RSD=1.9%，表明该方法重复性好。

图1 空白溶液

图2 对照品溶液

表1 线性结果

2.6 仪器精密性试验

取一定浓度的样品溶液连续进样6次，RSD=0.68%，表明在所选定的色谱条件下，系统稳定，仪器精密性好。

2.7 回收率试验

取6份已知含量的样品，分成3组，每组分别加入对照品溶液（100 µg/ml）0.06、0.12、0.18 ml，进行衍生化处理后，进样测定峰面积。以测得量与样品含量和加入量比较，计算回收率，结果见表2。测得平均回收率为86.79%，RSD=3.31%（n=6）。

2.8 样品含量测试

取同一批样品，按照“2.2.1”和“2.2.5”项下平行配制3份供试品溶液，以每6个分析样品和一组校正液成一个测试组的方式，分别进样，记录峰面积并计算含量[骨水泥标称含量为19.97 mg/g，含量=检测浓度×100/（骨水泥重量×标称含量），此计算浓度和标准校正浓度均为衍生化前]，结果见表3，测量结果均在标称值的±10%以内。

表2 加标回收试验结果（n=6）

表3 样品含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 内标物的选择

由于硫酸新霉素与硫酸庆大霉素均属于氨基糖苷类抗生素，结构相似，理化性质（极性、溶解度等）接近，在试验所设定的色谱条件下与样品中待测组分可充分分离。采用内标法测量可在一定程度上消除进样量、仪器不稳定等变化所引起的系统误差。

3.2 检测器波长的选择

将硫酸庆大霉素对照品进行衍生化处理后，采用紫外-可见分光光度计，在240～320 nm 波长范围内进行扫描，确定待测物质的最大吸收波长为265 nm，并以此作为检测波长。

3.3 衍生化处理及衍生条件的控制

因硫酸新霉素与硫酸庆大霉素缺乏紫外及荧光吸收，其含量无法用常规紫外或荧光检测器直接测得，因此需进行衍生化处理后再进行检测。由于硫酸庆大霉素只在衍生化处理后的较短时间内保持稳定，所以本方法采用Fmoc-Cl 试剂，对样品进行柱前衍生化后再用高效液相色谱法检测。

衍生条件也会对试验结果产生较大的影响。当试剂Fmoc-Cl 浓度为8 mmol/L 时，反应时间在10 min 以上，可得到较高的响应值。在衍生化时，若乙腈不足，会导致Fmoc-Cl 的析出；若乙腈过量，硫酸庆大霉素、硫酸新霉素和硼酸缓冲液会产生沉淀，因此，在衍生化中保持乙腈与水的比例为1:1至关重要。

3.4 稳定性试验

由于硫酸庆大霉素的衍生化在短时间内稳定，所以本试验未进行稳定性试验。为保证测定结果可靠，本试验采用最多6个分析样品和3个校正液成一个测试组。

3.5 结果分析

本试验待测组分有4个色谱峰，应按峰面积加和法计算，此方法更能准确测定硫酸庆大霉素的总量。

3.6 方法优势

本试验采用高效液相色谱法对同批3件骨水泥进行测试，结果表明，该方法操作简单，重复性好。由于对带药骨水泥的含量测定方法的国内报道不多，故此研究为保证该产品的质量提供了参考。