安徽结香花蕾中总黄酮的含量测定

班超，秦亚东*，李林华,2

(1. 安徽中医药高等专科学校，安徽 芜湖 241002；2. 安徽中药资源研究所, 安徽 芜湖 241317)

瑞香科植物结香(EdegeworthiachrysanthaLindl.)的花蕾、根和茎皮均可入药[1]。其花蕾为广西等地区的民族药物，是瑶族经典老班药物“五虎、五牛、十八钻、七十二风”中风类的常用代表药材，尤其是在瑶族地区有悠久的药用历史，别名梦花、新蒙花等，具有养阴安神，明目，祛障之功[1-3]，因结香花蕾与中药材密蒙花的性状以及药用价值较为相似，常作为密蒙花的替代品[2]。

现代药理研究证实结香花提取物均有明确的药理活性，如抗菌作用[4]，抗氧化[5]等作用；化学成分以香豆素和黄酮类化合物为主[6]，如芦丁、银椴苷、山奈酚-3-O-吡喃葡萄糖苷等黄酮类化合物[7]。众所周知，药用植物中黄酮类化合物具有广泛而明确的药理作用，也是中药材发挥药效作用的主要化学类型之一，常作为药材质量控制指标。由于民族药物开发研究缓慢，目前针对结香花中的总黄酮含量研究极为罕见，为提高作为药材的结香花质量标准，采用紫外分光光度法建立了安徽不同产地结香花中总黄酮的含量测定方法，本方法测定结果准确、稳定、重复性好、简便可行，为结香花的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Cary60型紫外分光光度计(美国Agilent公司)；DV215CD型十万分之一精密电子天平(美国Ohaus公司)；FA1204N型JK-250DB型万分之一精密电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；超声波清洗仪(合肥金尼克机械制造有限公司)；Minispin型台式离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 材料

结香花采自安徽省内六安市、安庆市等地区，采集时间为2019年1～2月份。新鲜花蕾经安徽中药资源研究所汪荣斌教授鉴定为瑞香科结香属植物结香 (EdegeworthiachrysanthaLindl.)的花蕾；芦丁对照品(批号：100080-201907)和D-无水葡萄糖对照品(批号：110833-201809)均购自中国食品药品检定研究院；亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇和强氧化钠等试剂均为市售分析纯。

表1 结香花样品信息表

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 芦丁对照品溶液的配制。精密称取干燥至恒重的芦丁对照品0.0160 g，以无水乙醇为溶剂，转移至100 mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.16 mg/mL芦丁对照品溶液，置4 ℃冰箱中，备用。

2.1.2 NaOH溶液的配制。准确称取NaOH固体4.0 g，以蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得浓度为4%的NaOH溶液。

2.1.3 NaNO2溶液的配制。准确称取NaNO2固体5.0 g，以蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得浓度为5%的NaNO2溶液。

2.1.4 硝酸铝溶液的配制。准确称取Al(NO3)3·9H2O固体17.6 g，以蒸馏水溶解后转移至100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得浓度为10%的Al(NO3)3溶液。

2.2 结香花供试品溶液的制备

新鲜结香花置于通风处自然晾干后，称取结香花干燥样品10.0 g置于圆底烧瓶中，加80%乙醇100 mL回流提取0.5 h，放冷至室温后滤过，滤渣中继续加入150 mL的80%乙醇100 mL再次回流提取0.5 h，放冷至室温后滤过，合并二次提取的滤液，定容至200 mL容量瓶中，置4 ℃冰箱中，备用。

2.3 总黄酮显色方法

参考文献方法[8-9]，对部分条件稍作调整，具体为：精密量取结香花供试品溶液和芦丁对照品溶液各1.00 mL分别转至2个10 mL容量瓶中，加入80%乙醇4.00 mL，摇匀后加入4% NaNO2溶液0.4 mL，摇匀后静置6 min后，加入10%的Al(NO3)3溶液0.5 mL，摇匀后静置6 min后，加入4%的NaOH溶液4 mL，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min，即可。以80%乙醇溶液为空白，分别将显色后的样品溶液和芦丁对照品溶液于400～760 nm扫描，结果发现，最大吸收波长在510 nm附近，故确定测定波长为510 nm。

2.4 方法学考查

2.4.1 线性范围的考查。分别精密量取芦丁对照品溶液(0.16 mg/mL)0.20、0.40、0.80、1.20、1.60 mL置于6个10 mL容量瓶中，其余操作按“2.3”项下方法进行，以80%乙醇溶液为空白，于510 nm波长下测定吸光度(A)值，以芦丁对照品浓度对吸光度A进行线性回归，线性回归方程为：A=6.52142×C-0.00021，R2=0.9995，说明芦丁在0.0032～0.0256 mg/mL浓度范围内与吸光度A呈良好的线性关系。

图1 芦丁对照品工作曲线图

2.4.2 精密度考查。取芦丁对照品溶液0.40 mL，按“2.3”项下方法进行显色处理，在510 nm下连续测定吸光度A值6次，结果相对标准偏差(RSD)为0.57%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4.3 重复性考查。称取6份干燥结香花样品各10.0 g，按“2.2”项下方法提取结香花样品中总黄酮，按“2.3”项下显色方法进行显色，所得6份结香花样品溶液分别于510 nm下测定吸光度A值，空白溶液为80%乙醇，结果6份样品吸光度A的RSD为1.43%(n=6)，说明所建立方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验。称取干燥结香花样品10.0 g，按“2.2”项下方法提取结香花样品中总黄酮，按“2.3”项下显色方法进行显色，所得结香花样品溶液分别于0、0.25、0.5、1、1.5、2 h 测定吸光度A值，结果吸光度A值RSD为0.86%(n=6)，表明结香花供试品溶液在2 h内稳定。

2.4.5 加样回收率试验。精密称取9份已知总黄酮含量的同一产地来源干燥结香花样品溶液1.00 g，分布精密加入芦丁对照品溶液等量，按“2.2”项下方法提取结香花样品中总黄酮，所加提取溶剂按料液比为1∶10进行，其余操作相同，按“2.3”项下显色方法进行显色，以80%的乙醇溶液为空白，于510 nm波长下测定吸光度，代入线性回归方程计算加样回收率。结果见表2，总黄酮平均加样回收率为 96.27%，RSD为0.55%(n=9)，表明该方法测定结果准确可靠。

表2 样品中总黄酮含量(%)

2.5 样品含量测定

精密称取安徽不同产地来源的干燥结香花样品各约10 g，按“2.2”项下方法提取结香花样品中总黄酮，其余操作相同，按“2.3”项下显色方法进行显色，以80%的乙醇溶液为空白，于510 nm波长下测定吸光度，代入线性回归方程计算各个产地样品中总黄酮含量。结果表明，安徽不同产地来源结香花样品中总黄酮含量在5.07%～8.61%，反映出安徽产结香花样品总黄酮含量相对均一稳定。

3 讨论

3.1 提取条件的优化，预试验中对提取溶剂、提取方式等进行了单因素考查。对水、甲醇、乙醇3种常用提取溶剂进行了考查，考虑到水为提取溶剂时提取温度较高，容易导致黄酮类化合物发生氧化等反应，而甲醇毒性较大，因此选择乙醇为提取溶剂，分别设计40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇和无水乙醇为溶剂进行单因素试验考查，结果发现80%乙醇为提取溶剂时总黄酮含量较高，因此，本试验选择以80%乙醇为结香花样品总黄酮提取溶剂；同时对回流提取、超声提取、渗漉提取方式进行了单因素考查，结果发现超声提取效率较低，可能是由于干燥结香花样品溶剂难以浸润有关，渗漉提取率较高，但耗费时间明显长于回流提取法，因此，本试验选择回流提取方式，提取2次后，继续回流提取，总黄酮含量未见明显升高，因此提取次数确定为2次；料液比也进行了单因素考查，料液比为1∶10时可以充分提取结香花中的总黄酮，继续提高料液比对总黄酮提取没有显著区别。

3.2 本试验参考相关文献报道，建立了安徽产结香花中总黄酮的含量测定方法，试验结果表明，该方法测定结果准确可靠、精密度和重复性良好、回收率高，操作简便易行，适用于安徽产结香花中总黄酮的含量测定。结果显示收集于安徽8个产地的结香花样品中总黄酮的含量介于5.07%～8.61%，表明安徽产结香花中总黄酮含量较为稳定，可用于安徽产结香花药材的质量控制。