蜂胶抗肿瘤功效成分研究

（聊城大学生命科学学院，聊城 252059）

蜂胶是由蜜蜂采集树脂并混入蜂蜡、花粉及自身腺体分泌物所得到的一种天然产物[1]，蜂胶的化学成分具有高度的复杂性和可变性[2]。迄今为止从蜂胶中鉴定出的化学组分高达 20多类、600多种，主要有黄酮类、酚酸类、萜烯酸、类固醇类、氨基酸类等[3]。由于蜂胶复杂的化学组分，使得蜂胶具备丰富而独特的生物活性，如抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等功效[4-8]。目前蜂胶广泛应用于食品、保健品和药品等行业，但其功效成分和作用机理还未完全阐明。

我们前期研究了蜂胶中分离纯化出的11种化学成分（咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、短叶松素、咖啡酸苄酯、咖啡酸苯乙酯、芹菜素、松属素、白杨素、高良姜素）的抗肿瘤活性，发现蜂胶中酚酸类物质的抗肿瘤功效较弱，黄酮及其酯类具有较好的抗肿瘤活性[9,10]；但蜂胶中这些抗肿瘤功效成分之间相互作用目前还缺乏研究。此外，前期通过不同浓度（40%～90%）的甲醇-水洗脱，我们从蜂胶乙酸乙酯提取物中分离出8段组分（Ⅰ-Ⅷ），并研究了这8段组分的抗炎功效，发现这8段组分对蜂胶的抗炎功效均有作用[11,12]。但这8段组分的抗肿瘤功效与抗炎功效是否相同，目前还不清楚。基于此，本研究通过8种不同肿瘤细胞，详细研究了不同浓度甲醇-水（40%～90%）洗脱的蜂胶中8段组分（Ⅰ-Ⅷ）的抗肿瘤功效，为蜂胶的抗肿瘤活性应用及质量控制提供基础实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

肺癌细胞（A549和H1299）、乳腺癌细胞（MCF-7和MDA-MB-231）、食管癌细胞（Eca109和TE-11）、胶质瘤细胞（U87）和宫颈癌细胞（HeLa）均由本实验室保存。

中国蜂胶产自山东省，胶源植物主要为杨属植物；DMEM培养基、RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；胰酶、磺酰罗丹明B（SRB）（sigma）；细胞培养皿、96孔板（Fisher公司）；Tris（上海生工）；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

HFsafe1200超净工作台、MCO-17A CO2培养箱（上海力康科学仪器有限公司）；TE2000S 倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；MK3酶标仪（芬兰雷勃公司）；AR2140电子分析天平（美国奥豪斯公司）；优普超纯水器（成都超纯科技有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 蜂胶脂溶性部位主要成分的制备、分离和鉴定

蜂胶水提物的残渣经乙酸乙酯浸提，然后经40%～90%浓度的甲醇-水洗脱，得到8段组分（Ⅰ-Ⅷ），具体步骤见参考文献[12]。其中，分离得到的8段组分，通过HPLC-DAD/Q-TOF-MS分析检测，主要成分见参考文献[12]。

1.3.2 细胞的培养

A549、H1299、MCF-7、MDA-MB-231、Eca109、TE-11、U87和HeLa细胞培养在添加10%胎牛血清的DMEM培养基或PRIM-1640培养基中。孵育条件为：5% CO2、37°C、饱和湿度CO2培养箱中。倒置相差显微镜下观察细胞形态。

1.3.3 细胞存活率的测定

将处于对数生长期的8种不同肿瘤细胞按4000个/孔种植到96孔板中，37℃、5% CO2孵育，待细胞长到60%以上，分别经25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的Ⅰ-Ⅷ 8段组分处理24h和48h。弃细胞培养液，用10%三氯乙酸4℃固定1h，水洗，晾干；然后用SRB染色10min，水洗，晾干；最后用100mM Tris碱溶解已着色的细胞，在492nm处测吸光值。

细胞存活率（%）=（处理组OD值/对照组OD值）×100%

1.4 数据统计

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料采取均数±标准差（±S）表示，用t检验进行统计学分析。P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2 实验结果

2.1 蜂胶中8段组分对肺癌A549和H1299细胞存活率的影响

肺癌是严重威胁人体健康的第一大恶性肿瘤。首先我们检测了蜂胶中8段组分（25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml）对两种肺癌细胞A549和H1299的存活率的影响。由图1可以看出，Ⅰ-Ⅷ 8段组分对A549和H1299细胞存活率的影响不同。在24h，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段组分对A549细胞增殖抑制功效显著；而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对H1299细胞抑制效果显著；在48h，随着作用时间的延长，Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段组分对A549细胞的抑制功效较24h显著，且呈剂量依赖性。同样，在48h，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对H1299细胞增殖的抑制功效随时间和浓度的增加效果也显著增强，而且Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ段对H1299的抑制功效比对A549细胞的抑制功效更显著。

图1 蜂胶中8段组分对肺癌A549和H1299细胞存活率的影响

2.2 蜂胶中8 段组分对乳腺癌MCF-7和MDAMB-231细胞存活率的影响

MCF-7是雌激素受体阳性的乳腺癌细胞，而MDA-MB-231细胞是三阴性乳腺癌细胞，具有更高的浸润和转移特征，预后效果较差。接着，我们检测了蜂胶中8段组分（25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml）对两种乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231存活率的影响。由图2可以看出，蜂胶中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的抑制效果具有时间和剂量的依赖性，而且在48h，蜂胶中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对MDA-MB-231细胞增殖的抑制效果较MCF-7更显著。

图2 蜂胶中8段组分对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞存活率的影响

2.3 蜂胶中8段组分对食管癌Eca109和TE-11细胞存活率的影响

食管癌是一种消化道恶性肿瘤，我国是食管癌的高发区。我们检测了蜂胶中8段组分分别对两种食管癌细胞Eca109和TE-11存活率的影响。如蜂胶中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制两种乳腺癌细胞一样，蜂胶中这四段组分抑制Eca109和TE-11细胞增殖也是呈时间和剂量依赖的，而且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对TE-11细胞的抑制功效较Eca109细胞更强。

图3 蜂胶中8段组分对食管癌Eca109和TE-11细胞存活率的影响

2.4 蜂胶中8段组分对胶质瘤U87和宫颈癌HeLa细胞存活率的影响

由图4A可以看出，蜂胶中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制胶质瘤U87细胞增殖随时间和剂量的增加，抑制效果也越显著。在24h时，蜂胶中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对HeLa细胞的抑制功效较其他段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）显著；在48h，除蜂胶中Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段抑制HeLa细胞增殖外，蜂胶中Ⅱ段也显著抑制HeLa细胞增殖。

图4 蜂胶中8段组分对U87和HeLa细胞存活率的影响

3 讨论

蜂胶的化学成分十分复杂，目前蜂胶应用中最大的难题就是药效不稳定，药效物质基础不明确。本实验通过8种不同的肿瘤细胞研究了蜂胶乙酸乙酯提取物经40%～90%甲醇-水洗脱后得到的8段化合物的抗肿瘤功效。结果发现，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段对8种不同的肿瘤细胞均有抑制功效，Ⅱ和Ⅵ对某些肿瘤细胞也具有一定的抑制功效。Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段甲醇-水的洗脱浓度在60%～75%之间，说明在这个浓度范围内，蜂胶乙酸乙酯提取物中的主要抗肿瘤功效成分被洗脱出来。尽管Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段甲醇-水的洗脱浓度较高，但是由于蜂胶中主要抗肿瘤功效成分已经在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脱出来，所以Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段对8种肿瘤细胞的抑制功效不显著；同样Ⅰ、Ⅱ段甲醇-水浓度较低，蜂胶中主要抗肿瘤功效组分洗脱下来的比较少，其抗肿瘤功效也较弱。这说明，首先甲醇-水的浓度决定了蜂胶乙酸乙酯提取物中抗肿瘤功效成分能否被洗脱下来；其次，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脱的甲醇-水浓度不同，其化学组分尽管不完全相同，但其对8种不同的肿瘤细胞均具有抑制功效，说明蜂胶抗肿瘤的功效成分是多种化合物共同作用的结果，而且主要是黄酮类化合物和酯类的种类和含量决定的，在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ段洗脱成分中，黄酮类化合物和酯类物质种类多，含量高；再次，通过Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段化学成分分析可以看出，尽管Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段中可能某一蜂胶抗肿瘤功效成分如白杨素含量较高，但其他抗肿瘤功效组分含量较少，导致Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ段抗肿瘤功效也不显著，说明蜂胶的抗肿瘤功效是由蜂胶中抗肿瘤功效成分的种类和含量决定的，两者缺一不可。

前期我们首先在蜂胶中分离出11种单体，测定了每一种单体的抗肿瘤功效，确定在蜂胶中发挥抗肿瘤活性的主要是黄酮类和酯类[10]。本实验通过不同浓度的甲醇-水洗脱出8段不同的组分，进一步确定了蜂胶抗肿瘤功效成分之间的相互作用和决定蜂胶抗肿瘤功效的关键因素。本实验研究为蜂胶的质量评价体系提供了一定的参考价值。