溴结构域蛋白4小分子抑制剂及其降解剂的研究进展

冯璐，王贯，欧阳亮

（四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，四川 成都610041）

溴 结 构 域 蛋 白（bromodomain proteins，BRDs）包含大约110个氨基酸，具有高度保守的功能结构域，可分为8大家族，其中溴结构域和超 末 端（bromodomain and extra-terminal，BET）家族最受关注。BET家族由4种蛋白组成，即BRD2、BRD3、BRD4和睾丸特异性含溴结构域蛋白（testis-specific bromodomain-containing protein，BRDT）。BRD4能解读表观遗传密码，识别乙酰化的组蛋白或非组蛋白，调控骨髓细胞瘤病毒癌 基 因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，C-MYC）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（kelch-like ECH associated protein 1，KEAP1）等多条信号通路，参与DNA的复制、转录以及细胞周期等过程[1-2]。BRD4的表达失调可导致白血病、乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤的恶性发展。作为一个重要的抗肿瘤表观遗传学靶标，多种BRD4小分子抑制剂和降解剂均表现出较好的抗肿瘤作用，其中OTX015、I-BET762以及I-BET151等已进入不同的临床试验阶段。本文重点综述BRD4小分子抑制剂及其降解剂的研究进展，为开发BRD4的新型抑制剂和降解剂提供参考。

1 BRD4的蛋白结构和信号通路

BRD4是BET家族重要的功能蛋白，能识别组蛋白中乙酰化的赖氨酸，在细胞周期、细胞分化和信号转导过程中具有重要作用。BRD4的N末端包含2个串联的高度保守的溴结构域，即BD1和BD2[3]。BRD4的溴结构域由4个反向平行排列的α螺旋组成，分别是αZ、αA、αB和αC。其中，αZ和αA、αB和αC之间形成了2个疏水loop环，能特异性地结合赖氨酸乙酰化物并辨别不同的蛋白复合物（见图1a和1b）。BD1和BD2的环状区域在序列和长度上略有差异，有助于提高BRD4与乙酰化赖氨酸结合的特异性[4]。BRD4的C末端包含一个超末端（extra-terminal，ET）结构域（见图1c），该结构域能与组蛋白修饰因子相互作用，主要负责调节基因转录[4]。其中，溴结构域是BRD4能够特异性识别乙酰化赖氨酸的重要区域，其BC环和ZA环在螺旋末端形成疏水空腔，在空腔中心，乙酰化赖氨酸能够与Asn140形成分子间氢键，并与Tyr97通过水分子介导形成分子间氢键，构成了抑制BRD4的重要位点。此外，BRD4的Trp81（W81）、Pro82（P82）和Phe83（F83）能够形成一个疏水区，即WPF，对提高BRD4的亲和力具有促进作用[5-6]（见图1d）。

DNA合成中，BRD4能参与细胞进程，促进细胞周期向S期转化，调控Aurora B激酶和E2F，影响G1相关基因的表达[13]。在DNA损伤反应通路中，BRD4能募集condensinⅡ，重塑染色质结构，抑制DNA的损伤[14]。炎症反应中，BRD4的溴结构域能与乙酰化的NF-κB p65（Rel A）结合，促进NF-κB的转录激活以及炎症基因IL-2、IL-8、CCL-2的表达，增加其转录活性[15]。在氧化应激反应中，抑制BRD4能使KEAP1通路失调，抑制HMOX1的表达和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，使氧化应激条件下细胞活性增加，发挥抗肿瘤作用[16]。此外，ET结构域能与NSD3、JMJD6、CHD4以及ATAD5结合，在染色质组织中具有组装和重组等重要作用[17-18]（见图2）。

2 BRD4与肿瘤的发生发展

作为表观遗传阅读器，BRD4能激活C-MYC等多种转录因子，从而调控基因转录，影响细胞周期、增殖和凋亡等生理学过程，在肿瘤细胞的浸润、转移以及肿瘤的恶性发展中具有重要作用。研究表明BRD4的表达上调会导致多种下游基因功能紊乱，与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。Zuber等[19]发现在急性髓性白血病（acute myelogenous leukemia，AML）中BRD4表达失调，功能紊乱。2011年，Dawson等[20]发现置换染色质中的BET蛋白能抑制BCL2、C-MYC和CDK等关键因子的表达，对混合谱系白血病（mixed lineage leukaemia，MLL）有治疗作用。2016年，Andrieu等[21]在研究BRD4在三阴性乳腺癌中的作用时发现，BRD4小分子抑制剂在三阴性乳腺癌中的作用机制主要与Notch信号配体Jagged1（JAG1）/Notch信号受体1（notch receptor 1，Notch1）相关。在黑色素瘤模型中BRD4抑制剂能下调S期激酶相关蛋白2（s-phase kinase associated protein 2，SKP2）、细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase 1，ERK1）和C-MYC，抑制黑色素瘤细胞的增殖以及肿瘤的生长和转移[22]。Li等[23]发现BRD4抑制剂JQ1能抑制C-MYC，诱导G1细胞周期停滞，抑制凋亡蛋白BCL2样蛋白11（Bcl-2-like protein 11，BCL2L11）的表达，从而抑制肝癌细胞生长，表现出抗肝癌作用。BRD4的高度表达与肺癌也密切相关，BRD4抑制剂能抑制抗凋亡蛋白BCL2，与BCL2抑制剂联合使用能诱导小细胞肺癌细胞凋亡[24]。

综上所述，BRD4的表达上调会导致其下游基因表达异常，在白血病、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等肿瘤的发生发展中具有重要作用。BRD4是重要的调控表观遗传的肿瘤相关蛋白，并且其小分子抑制剂具有良好的抗肿瘤作用。因此，开发抑制BRD4的小分子化合物是该领域的研究方向之一，为肿瘤治疗提供了新的选择。

3 BRD4小分子抑制剂

BRD4小分子抑制剂能下调C-MYC等多种转录因子，具有良好的抗肿瘤效果。因此，寻找BRD4的小分子抑制剂具有重要意义：一方面为全面深入研究BRD4抑制剂在不同肿瘤中的作用机制提供新分子；另一方面为多种恶性肿瘤的治疗提供候选化合物。BRD4小分子抑制剂与溴结构域有高度的亲和性，按照其结合方式可分为2类，即单价抑制剂和二价抑制剂。目前，BRD4小分子抑制剂的研究主要集中于单价抑制剂。单价BRD4抑制剂能与BD1或BD2结合，根据其化学结构的特征主要分为：三氮唑类、异唑类、喹啉酮类、吡啶酮类以及四氢喹啉类等。二价抑制剂能同时与BD1和BD2结合，亲和力较高。本文将针对2类BRD4小分子抑制剂的研究进行综述。

3.1 单价抑制剂

3.1.1 三氮唑类JQ1（1）是通过高通量筛选发现的首个BRD4单价抑制剂，属于三氮唑类化合物[7]。共晶结果表明，JQ1通过甲基三唑基团和Asn140形成了氢键，噻唑环伸展于疏水的ZA环，苯环位于WPF疏水区，完全占据了BRD4的乙酰化赖氨酸结合位点（见图3）。JQ1对BD1的IC50为77 nmol · L-1，平衡解离常数（Kd）为50 nmol · L-1。在多发性骨髓瘤模型中，JQ1能抑制转录因子C-MYC，表现出较强的抗肿瘤作用[25]。因此，JQ1的发现表明BRD4小分子抑制剂在肿瘤治疗中具有较大的潜力。

为改善JQ1半衰期较短、用量和毒性较大的问题，研究人员对JQ1进行优化，并报道了多种三氮唑类BRD4小分子抑制剂，如OTX015（2）、CPI203（3）和MS417（4）。其 中，OTX015能抑制BRD4和C-MYC，并已进入临床试验阶段（NCT02698189/NCT02698176/NCT01713582/NCT02259114）[26-27]。CPI203的IC50为37 nmol · L-1，与来那度胺联用能下调C-MYC和IRF4，诱导细胞凋亡[28]。MS417对BD1的IC50为30 nmol · L-1，Kd为36.1 nmol · L-1[29]。

2013年，葛兰素史克公司通过表型筛选发现载脂蛋白A1（apolipoprotein A1，ApoA1）的调节剂化合物5对BRD4的pIC50为6.3，并且研究表明ApoA1的上调是由BET蛋白介导的[30]。随后以化合物5为先导化合物，将氨基甲酸酯基团替换为酰胺，在2个苯环上分别引入氯原子和甲氧基，并用乙基取代苄基，发现了具有优异理化性质的I-BET762（GSK525762，6）。化合物6的pIC50为6.2，代谢稳定性增强，溶解度提高，生物利用度良好，并与Asn140形成了关键的氢键（见图4）。目前，I-BET762已进入临床试验阶段（NCT01943851/NCT01587703/NCT02964507）[31]。此外，三氮唑类化合物7与JQ1的结合模式相似，并能下调IL-6的表达[32]。

对于清代文献传承而言，朱彝尊编撰、整理之著述，大大丰富了古代文献的内容。朱氏也以其繁富之著述，跻身清初文献大家之列。其著述以编撰为主，因此对于保存前人著述，尤其是易代人物之著述，功不可没。随着时间的推移，许多古人著述或见解因水火兵燹而逐渐沦亡、散佚，幸而能于朱氏著述中，存其大体或部分片段，使今人尚得以管窥一二。执此以论，朱彝尊对于保存、传承文献而言，可谓成就斐然。兹举一例：《经义考》卷二百一十一论语类“《古论语》”一条，引“谭贞默曰”：

异唑类BRD4小分子抑制剂研究最多的是I-BET151（8，NCT02630251）[34]。I-BET151的异唑的氧原子与Asn140形成了关键的氢键，2-甲基吡啶与WPF疏水区形成范德华力（见图5）。I-BET151与BET家族的亲和力高，Kd小于100 nmol · L-1。I-BET151能够抑制BD1，IC50为790 nmol · L-1，在MLL-AF9和MLL-AF4小鼠模型中表现出显著的抗白血病作用[35]。此外，I-BET151能降低炎症因子IL-6的水平，具有抗炎作用。

2013年，Hay等[36]发现了选择性的BRD4小分子抑制剂9，其IC50为790 nmol · L-1。2014年，Engelhardt等[37]发现化合物10能抑制BD1，其IC50为14 nmol · L-1。Aktoudianakis等[38]发现化合物11对BD1具有抑制活性，其IC50为12.9 nmol · L-1。此外，化合物11还能下调C-MYC，EC50为13.2 nmol · L-1。

2016年，Albrecht等[39]发现异唑类BRD4抑制剂CPI0610（12）抑制BD1的IC50为39 nmol · L-1，药代动力学参数理想。Hewitt等[40]以CPI0610的结构为基础引入了乙酰胺取代的吡唑环，生成了化合物13。共晶结果表明，化合物13的二甲基异唑的氧与Asn140的氨基形成了氢键，氮原子与Tyr97的苯酚通过水分子相互作用，甲基与WPF疏水区相互作用。

3.1.3 喹啉酮类喹啉酮类的代表性化合物是辉瑞公司研发的PFI-1（14）[41]。PFI-1喹啉酮的羰基和氮能与Asn140形成氢键，羰基与Tyr97形成由水分子介导的氢键，磺酰胺的NH通过水分子介导与ZA环的Val87形成氢键（见图6）。PFI-1对BD1的IC50为220 nmol · L-1，能抑制白血病细胞的增殖，影响白血病细胞周期，下调C-MYC，诱导白血病细胞凋亡和分化。但PFI-1药代动力学特征差，半衰期短，生物利用度低，仅为32%。PFI-1还能显著下调激酶Aurora B，Aurora B的活性与C-MYC的功能相关。

3.1.4 吡啶酮类2017，Mcdaniel等[43]发现ABBV-075（15，NCT02391480）与BRD4结合 的Ki为1.5 nmol · L-1，在AML小鼠模型中抗肿瘤活性和耐受性较好。ABBV-075能抑制肿瘤细胞的增殖，EC50为13 nmol · L-1。此外，ABBV-075药代动力学特征良好，口服生物利用度为50%，半衰期（T1/2）为25 h。2017年，Wang等[44]基于NMR片段筛选发现了新型的吡啶酮类化合物16。化合物16与BRD4的亲和力高，Ki为1.5 nmol · L-1，EC50为5.6 nmol · L-1。共晶结果表明，化合物16的吡啶酮的羰基和BRD4溴结构域BD2的Asn433形成了氢键，碳环位于WPF疏水区，磺酰胺和Asp381相互作用。

3.1.5 四氢喹啉类2014年，葛兰素史克公司开发了一种新的、有选择性的四氢喹啉类BRD4小分子抑制剂I-BET726（GSK1324726A，17）[45]。共晶结果表明，I-BET726的N1乙酰基与Asn140的氨基形成第1个氢键，并通过水分子介导与Tyr97形成了第2个氢键（见图7）。此外，I-BET726的N1乙酰基的甲基占据了水分子与Phe83所形成的口袋，C2甲基占据了ZA环中Leu110附近的疏水空腔，与Leu94直接接触，氯苯基与WPF疏水区结合。I-BET726具有高度的选择性和亲和性，表面离子体共振实验中的Kd为23 nmol · L-1，等温滴定量热法中的Kd为4.4 nmol · L-1。I-BET726能下调BCL2和骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源基因MYCN，强烈抑制神经细胞瘤细胞系的增殖，IC50为75 nmol · L-1[46]。

3.1.6 其他BRD4小分子单价抑制剂2016年，Li等[47]发现了新的苯二氮䓬酮类BRD4小分子抑制剂18。在白血病细胞中化合物18表现出显著的抗增殖活性，并能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。分子对接表明，化合物18与Gln85形成了氢键，并与Phe83、Val87、Leu92、Cys136和Ile146形成了疏水作用。2017年，Ouyang等[48]发现在乳腺癌中自噬相关蛋白腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）显著下调，并设计了一种高效的选择性的BRD4小分子抑制剂19。化合物19能阻断BRD4与AMPK的相互作用，激活乳腺癌细胞中AMPK-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）-UNC-51-样激酶1（UNC-51-like kinase 1，ULK1）自噬通路，诱导自噬相关基因-5（autophagy related gene-5，ATG5）依赖的自噬相关细胞死亡。在乳腺癌小鼠和斑马鱼模型中，化合物19具有可观的治疗作用，为乳腺癌的治疗提供了有希望的候选化合物。

3.2 二价抑制剂

目前针对BRD4已开发出多种小分子抑制剂，但主要集中于抑制单一的溴结构域，选择性不高，抗肿瘤效果也有限。而且BRD4小分子抑制剂出现了耐药性的问题。为克服单价抑制剂的耐药问题，发展了二价抑制剂，与单价抑制剂相比，二价抑制剂的亲和力大，抑制效率高，是实现与目标蛋白有效结合的一种新策略。因此，也是研发BRD4小分子抑制剂研究热点之一。

2016年，Bradbury等[49]对雄激素受体调节剂AZD3514（20）进行结构优化时，发现BRD4二价抑制剂21对BRD4的溴结构域BD1和BD2有较强的抑制作用，pKd分别为7.2和6.1[49-50]。为提高化合物21与乙酰化赖氨酸的结合能力，在结构中引入了三氮唑吡啶基团，得到了化合物22和23（AZD5153)。与化合物21相比，化合物22的抗增殖活性提高，抑制BD1和BD2的pKd分别为8.1和7.3。AZD5153的哌嗪环的羰基和三唑环的氮与Asn140形成了氢键（见图8）。AZD5153的IC50为5 nmol · L-1，能显著抑制C-MYC，药代动力学特征良好，并已进入临床试验阶段（NCT03205176）[51]。

2016年，Tanaka等[52]将2个JQ1分子用聚乙二醇链连接在一起，设计了一种分子内的BRD4二价抑制剂MT1（24）。与JQ1相比，MT1能显著延迟白血病的进展，抗肿瘤活性提高，主要与其对BRD4的二聚能力有关。此外，在浓度为100 nmol · L-1时MT1能显著抑制C-MYC，上调环六亚甲基二乙酰胺诱导蛋白（hexamethylene bis-acetamide inducible 1，HEXIM）的表达。

4 BRD4蛋白降解剂

BRD4在多种恶性肿瘤的基因调控网络中具有重要作用，是具有可观前景的肿瘤治疗靶标。但Winter等[53]认为小分子抑制剂会破坏目标蛋白的区域活性，而且研究表明BRD4抑制剂会导致BRD4蛋白在体内大量积累，抑制效率降低。重要的是，BRD4小分子抑制剂的耐药问题使其无法在临床上发挥理想的肿瘤治疗作用。因此，开发有效的多结构域蛋白的小分子抑制剂具有较大挑战性。2001年，Sakamoto等[54]提出了蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras，PROTACs）的概念。PROTACs包含3个组成部分：目标蛋白特异性配体、E3泛素连接酶配体和连接配体的Linker。PROTACs通过设计双功能分子靶向目标蛋白和E3泛素连接酶，从而促进E3连接酶将目标蛋白泛素化，并通过蛋白酶体降解。因此，与传统的小分子抑制剂相比，PROTACs不仅能作用于非药物靶点，降解目标蛋白，还能克服耐药性问题，为临床提供了一种新的思路。靶向BRD4的PROTACs主要分为2类：第一种是募集E3泛素连接酶Cereblon（CRBN）的蛋白降解剂，主要是基于沙利度胺衍生物的设计；另一种是募集E3泛素连接酶Von Hippel-Lindau（VHL）的蛋白降解剂，主要是基于VHL配体的设计。本文将对这2类BRD4蛋白降解剂进行综述。

4.1 募集E3泛素连接酶CRBN的PROTAC

2015年，Winter等[53]将沙利度胺衍生物与BRD4抑制剂JQ1相连接，设计了一种募集CRBN的降解剂dBET1（25）。与JQ1相比，dBET1在体内外均能选择性地诱导BRD4的降解，在浓度低至100 nmol · L-1时可以完全降解MV4-11白血病细胞中的BRD4，并显著抑制C-MYC的转录。在AML小鼠模型中，dBET1能降解BRD4，下调C-MYC，延缓小鼠白血病的进展。

2017年，Bai等[55]通过聚乙二醇的柔性链连接了来那度胺和BRD4抑制剂HJB97，设计了第2代BRD4的降解剂BETd-246（26）。BETd-246选择性高，在三阴性乳腺癌细胞中IC50小于10 nmol · L-1，并能导致生长抑制和细胞凋亡。BETd-246诱导BRD4降解的关键下游因子是髓细胞白血病基因1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）。Zhou等[56]对BETd-246进一步优化，发现与BETd-246相比，BETd-260（27）在乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468异种移植模型中的抗肿瘤活性提高。

基于CRBN配体的BRD4蛋白降解剂还包括ARV-825（28）和QCA-570（29）[57-58]。ARV-825对BD1和BD2的Kd分别为90和28 nmol · L-1，在半数降解浓度（DC50）小于1 nmol · L-1时能抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡。QCA-570可以有效地诱导BET蛋白的降解，在小鼠白血病异种移植模型中，能实现肿瘤完整和持久的消退，并且没有明显的毒性。ARV-771还能抑制雄激素受体（androgen receptor，AR）的表达水平，诱导肿瘤部分消退。此外，基于VHL配体的BRD4蛋白降解剂还有MZP-54（31）、MZ1（32）等，均能有效降解BRD4[60-61]。

4.2 募集E3泛素连接酶VHL的PROTAC

2016年，Raina等[59]发现ARV-771（30）在去势抵抗性前列腺癌模型中表现出明显的抗肿瘤作用，DC50小于50 nmol · L-1时能显著诱导BRD4的降解，并且在IC50小于1 nmol · L-1时C-MYC蛋白降解完全。

5 结语与展望

BRD4参与细胞增殖、细胞凋亡、染色质的组装与重组、炎症反应以及氧化应激等多种生理学过程，是基因调控网络中的关键因子。虽然研究表明BRD4在白血病、乳腺癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的发生发展中具有关键作用，且部分BRD4抑制剂在恶性肿瘤的临床试验中取得了一定成效，但BRD4在不同肿瘤中的作用机制、耐药机制仍需多组学的全面研究。BRD4单价抑制剂仅能抑制单一的溴结构域，结构改造较为单一，抑制效率和抗肿瘤效果受限。二价抑制剂虽提高了抑制效率和抗肿瘤效果，但主要是通过柔性Linker连接了2种单价抑制剂，相对分子质量大，成药性差。PROTAC的出现为解决BRD4小分子抑制剂的耐药问题提供了新的策略。与小分子抑制剂相比，BRD4蛋白降解剂能降解靶蛋白，抗肿瘤活性更强。但BRD4蛋白降解剂分子量大，理化性质较差，生物利用度低。因此，仍然有必要且存在较大的空间研发结构多样的BRD4的小分子抑制剂、PROTACs蛋白降解剂或双靶抑制剂，一方面为研究BRD4的作用机制、耐药机制提供不同化学类型的BRD4抑制剂；另一方面，为以BRD4为靶点的肿瘤治疗带来新希望。