抗氧化剂在猪精液冷冻保存中的作用

康乐毅 ，赵俊金 ，邓晓彬 ，程 晨 ，刘 刚 ，张永红 ，郭 勇 ，邢 凯 ＊,倪和民 ＊

（1.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206；2.全国畜牧总站，北京 100193；3.北京田园奥瑞生物科技有限公司，北京 100096；4.中国农业出版社有限公司（数字出版与管理中心），北京 100125）

猪繁殖技术发展趋势由自然繁殖过渡到鲜精繁殖再到冻精繁殖。与常规液态保存精液相比较，猪的冷冻精液繁殖技术成绩并不理想。文内就近几年应用在猪冷冻精液的新型抗氧化剂进行综述，完善猪冷冻精液技术的相关研究理论。希望最终加大推广冻精使用的力度，提高生产效益。

1 猪精子冷冻过程中的氧化损伤

哺乳动物精子细胞具有高度特异的脂质组成，高含量的多不饱和脂肪酸、血浆蛋白原和鞘磷脂。这种不同寻常的精子膜结构决定了它的灵活性和精子细胞的功能能力。然而，精子的脂质是过氧化的主要底物，可能会引起严重的精子功能障碍。另一方面，低（生理）水平的脂质过氧化反应反映了活性氧（ROS）对精子代谢的影响，增强了精子与透明带相互作用的能力[1]。精子膜的病理性脂质过氧化程度较高的一个原因可能是氧化应激失衡。

多不饱和脂肪酸（PUFAs）在精子细胞膜中的过氧化反应是一种自催化、自繁殖的反应，可引起细胞功能障碍。过氧化反应的第一步，称为起始反应，是从不饱和脂肪酸中提取一个氢原子。第二步增殖是脂质烷基自由基的形成，然后与氧快速反应，形成脂质过氧化自由基。由于过氧自由基和烷基自由基被再生，繁殖循环可以无限期地持续下去，直到自由基反应中某个底物被消耗或终止[2]。

此外，精子膜脂参与配子的相互作用。其中一种是半乳糖基甘油脂质[3]，另一种是溶血磷脂酰胆碱[4]，可刺激精子受精能力，引起透明带成分的改变，并促进卵膜的精卵融合。总之，位于精子膜中的全脂成分参与调节精子成熟、精子发生、获能、顶体反应并最终参与膜融合。显然，精子脂质过氧化也会干扰上述精子的所有功能，极端情况下甚至会完全抑制精子的形成。

过量的自由基产生经常涉及精子发生的错误，导致精子从生发上皮释放，表现出异常高水平的细胞质保留。多余的细胞质中含有酶，为精子的质膜氧化还原系统进一步生成ROS提供燃料。这种氧化应激的后果包括精子丧失运动性和受精潜力，以及诱导精子细胞核的DNA损伤。精子功能的丧失是由于精子原生膜中的不饱和脂肪酸发生过氧化作用，导致精子丧失流动性，细胞丧失功能[5]。

2 抗氧化剂在猪精液冷冻保存中的作用

抗氧化剂的使用可以将氧化损伤的破坏降低，并显著提高解冻后精子的各项指标。最近几年，许多研究人员在稀释液内添加不同的抗氧化剂[6]，证明了抗氧化剂在精液冷冻保存上起到了重要作用。

2.1 芝麻酚

芝麻酚是芝麻油中的重要的香气成分，是芝麻油的品质稳定剂。易溶于极性有机溶剂，是一种常见的抗氧化剂。

芝麻酚作为承担抗氧化作用的内活性物质、保护不饱和脂肪酸不被氧化[7]，故芝麻油要比其他植物油更为稳定。在食品领域，添加芝麻酚可延长食品的保存时间[8]，提高油脂的抗氧化能力。在医学领域中，特别在医学损伤防护上，芝麻酚也发挥着保护作用。在降低DNA损伤[9]、提高DNA自我损伤修复能力[10-11]效果明显。

王捷[12]等人通过实验证实添加适量的芝麻酚可以显著提高精子解冻后指标以及精子内抗氧化酶活性，添加0.2 g/L的芝麻酚时精液保存效果最好。

2.2 葡萄籽原花青素

葡萄籽原花青素是从葡萄籽中提取出的新型抗氧化剂，同时也是目前为止发现的最强效自由基清除剂[13]。李春阳等人[14]研究发现葡萄籽原花青素的抗氧化、清除自由基的能力随着纯化程度的提高也相应地提高。

孙艳青[15]等人发现添加葡萄籽原花青素对猪精子起到了很好的抗氧化保护能力，最适添加浓度为40 μg/mL，可以显著降低丙二醛水平，解冻后精液各项指标均得到提升。

2.3 维生素P

维生素P是一种植物次级代谢产物，又名芦丁、橘皮素等[16]。维生素P具有增强其他维生素功效、防止瘀伤、增强机体对传染性疾病的抵抗及抗氧化[17]等作用。

维生素P具有心脏保护[18]、抗菌消炎、抗癌、调节毛细血管通透性的作用，临床上用于治疗高血压、心脑血管疾病等，起到了不错的治疗效果。前人研究表明，维生素P具有清除自由基的功能[19]。夏维木[20]证明维生素P可以清除超氧根离子，并且清除的效率很高。同时维生素P由于结构的特殊性，能够螯合金属离子，起到抵抗脂质过氧化的功能，从而保护精子，减少损伤。维生素P作为酮类化合物，其结构与活性之间存在密切的关系。基团的数量和结构都会影响活性[21]。

吴琳[22]研究发现在冷冻保存的过程中，添加0.6 mM的维生素P，可以显著提高精子的结构完整性，提高抗氧化酶的酶活性，降低有害代谢产物含量。相比较而言，当添加1.0 mM和2.0 mM的维生素P后并没有明显提高精子的生理特征，很可能是由于添加高浓度的维生素P使得细胞的渗透压增大，改变了精子的生存环境。

2.4 α-硫辛酸

α-硫辛酸（Alpha-lipoic acid，ALA）是一种来源于辛酸的有机硫化物，它是一种天然的抗氧化剂，广泛存在于动物体内，作为许多酶的必须因子来参与机体生化反应。

由于α-硫辛酸是一种天然强抗氧化剂，因此在国际上对于α-硫辛酸的研究从来都未停止过。α-硫辛酸能够有效降低经高葡萄糖诱导的PC12细胞损伤[22]。Park[23]等研究发现α-硫辛酸可以上调抗凋亡和抗氧化基因的表达，以此可以改善内皮功能紊乱。在α-硫辛酸对精子冷冻保存影响方面，Ma等人[24]研究发现α-硫辛酸能够提高山羊精子活力及在精子介导的转基因过程中保护精子不被氧化损伤。

胡晓辰[25]通过实验证实冷冻基础液中单独添加一定浓度的α-硫辛酸和维生素C均能有效提高冻后猪精子总抗氧化能力和抗氧化酶活力；其最佳浓度分别为6.0 mg/L和400 mg/L；联合添加二者的冷冻保存效果优于单独添加，其最佳配伍浓度为4.0 mg/Lα-硫辛酸和600 mg/L维生素C。

2.5 中草药提取物

2.5.1 灵芝多糖

灵芝在我国具有400多年的悠久应用历史[28]，灵芝属真菌。灵芝多糖是从灵芝中提取出来具有生物活性的一种物质，其具有调节免疫[29]、抗氧化[30]、抗癌[31]、防衰老、改善睡眠、降低血糖等生理活性[32]。

吴琳[22]通过实验证实在冷冻精液保存的过程中，添加0.8 mg/mL的灵芝多糖，可以显著提高精子结构完整性及抗氧化酶活性，但对线粒体活性没有显著的增强作用。

由于灵芝多糖是一种大分子的物质，不能够进入到精子的细胞内部，只能够在精子细胞的外面进行保护。推测其保护机制可能是在细胞膜的外边形成一层保护膜，进而使得膜和顶体的完整性提高，但不能够对线粒体进行保护，同时研究表明当灵芝多糖的浓度过高时，精子的活率开始降低，很可能是由于多糖自身具有黏性，吸附在精子的周围，从而阻碍了精子的运动，使得活率降低。还可能是因为线粒体是精子运动的能量来源，而灵芝多糖并不能提高线粒体的活性，从而使得精子的运动能力降低，从而导致活力降低[32]。

2.5.2 丹参酮 IIA

丹参酮IIA（TanshinoneⅡA）是唇形科植物丹参的主要提取成分[33-34]。吴琳[22]通过实验证实在常温保存中，在猪精子常温稀释液中添加0.9 mM的丹参酮IIA，可以显著提高精子质膜及顶体完整性。在冷冻保存的过程中，在猪精液冷冻稀释液中添加1.2 mM的丹参酮IIA，可以显著提高精子质量，显著降低MDA含量和提高抗氧化酶中SOD酶活性和GSH-Px酶活性，但对质膜的完整性和CAT酶的活性的提升没有作用。

2.6 其他抗氧化剂

褪黑素是色氨酸的衍生物，主要在松果腺合成和分泌，也存在于哺乳动物的卵巢、睾丸、骨髓、视网膜和晶状体等多种组织中。褪黑素具有多种重要的生理功能，如控制昼夜节律、诱导睡眠、调节季节性繁殖、增强免疫力和抗氧化作用等。褪黑素最基本的功能被认为是它的抗氧化功能，它可以保护生物体免受氧化损伤。褪黑素也是一种强有力的自由基清除剂，包括可以清除引发脂质过氧化的过氧化物自由基和羟基自由基。

此外维生素C、维生素E、谷胱甘肽及一些内源的超氧化物歧化酶与过氧化氢酶也在精液抗氧化上发挥着作用。由于前人对这些抗氧化剂研究较为深入，故在此不多做介绍。

3 展望

非洲猪瘟形势下，活体引种和鲜精运输受限，使用猪冻精配种的猪场正在逐步增加。据报道，猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒等病毒能通过精液传播，精液存在垂直传播病毒的风险；冻精的长时间保存特性可以使人们有充足的时间检测各种健康指标，杜绝精液垂直传播疾病的风险；冻精的长距离运输、长效保存，突破了时空限制，使养猪生产上可实现精准实时选配。随着未来在新型抗氧化剂探索及抗冻剂稀释液的优化上研究逐步深入，猪冷冻精液的推广和使用势必发展迅速，其解冻后指标也逐渐向鲜精靠拢。