影响“植物组织与细胞培养”实验的关键因素探析

李立群，徐淑兔，李春莲

（西北农林科技大学农学院，陕西 杨凌 712100）

农学类本科生《植物组织与细胞培养》实验的目的，是让学生应用无性生殖的原理，掌握无菌条件下植物组织或细胞的脱分化、再分化及再生技术，进而培养出完整植株，并会应用于生产实践[1]。要想得到预期的实验结果，外植体能形成愈伤或分化出小芽，成为继代培养的稳定材料，完成植株再生，最重要的因素是洁净的试验环境、无菌无毒的实验材料、实验者娴熟的操作技能和实验过程的无污染。本文具体分析了《植物组织与细胞培养》实验室准备状况及本科生实验过程存在的主要问题与现象，提出改进措施。让同学们真正掌握植物组织与细胞培养技术和无菌操作技术，克服实验过程的缺陷和不足，为今后遗传转化研究和组培工厂化生产奠定良好的基础。

1 实验环境和实验设备的准备

植物组织与细胞培养实验技术性、操作性强，且整个实验过程都是在无菌条件下进行的。一方面，操作环境要达到无菌要求，另一方面操作过程要严格无污染。否则，将严重影响实验结果。若接种室、培养间环境卫生不达标、空气不洁净，潜藏真菌、细菌、病毒等微生物，就会导致实验环境被污染[2-4]，不能开展教学实验。所以，建立无菌环境、消灭环境污染是实验准备阶段的第一要务。

首先，实验室布局要合理。无菌操作室和培养室不仅要单独设置，要与高压灭菌室及实验准备室隔离开来。绝对禁止微生物、泥土和未穿实验服的人员随意进入。要随手关门，防止外来杂菌的入侵。由于造成环境污染的各类真菌、细菌、病毒不易被发觉，较难控制，只能勤消毒、勤通风及时控制。实验期间坚持每天灭菌消毒，消灭细菌、真菌、病毒。用1∶200的巴斯消毒液擦拭实验台、喷洒门窗及窗帘；1∶100的巴斯消毒液拖净地板，消毒作用时间至少30 min，然后再用质量分数75%的酒精喷洒室内，使灰尘落地，防止微小尘粒飞扬，然后紫外灯加紫外灯车移动照射30 min全方位杀菌消毒，消除空气中气溶胶中的病毒、细菌等有害成分，为实验准备一个良好的环境。

超净台内部环境不合格等于实验无效，所以，使用前先用巴斯液擦拭消毒，再用质量分数75%酒精喷洒消毒，待干燥后开启通风装置，紫外灯照射灭菌30 min。实验结束后同样要做这三步消毒，以防交叉污染。高压灭菌容器使用前要彻底清洗，内外桶要用酒精消毒，锅底注入蒸馏水或纯净水，每周更换一次。及时检查密封圈，若变形立即更换；按时效验安全阀、压力表；并制定严格的灭菌操作制度，规范使用灭菌器，保证压力容器工作状态正常，达到良好的灭菌效果。

所有实验用品包括培养基母液、培养基、蒸馏水和培养瓶都要包扎后进行高温高压灭菌，即121°或105p持续30 min，杀灭细菌和真菌；操作工具如镊子、手术刀、解刨针等金属器具初次实验前也要包扎好高压灭菌，每次实验前用红外消毒器400°干热灭菌30 min。近几年本实验室没有发生过培养基污染的现象，这可能与内环境清洁消毒到位，灭菌过程严格按规程操作有关。

2 外植体的选择和消毒

实验过程中外植体灭茵操作直接影响实验操作的成效。外植体即实验材料的选择是否合适、消毒的彻底与否皆至关重要[5]。的教学实验项目涉及烟草、油菜、大豆、豌豆、甘薯、小麦、马铃薯、胡萝卜、月季等植物，消毒方法和消毒时间都不一样。其中，叶片、幼嫩茎芽、易消毒，用时短，接种易成功；后4种作物较难消毒彻底，如小麦种子有腹沟，尾部毛刷结构，包藏的污染源较多，比烟草叶片多用一倍的时间也不一定能彻底去除杂菌。曾经尝试过仅用酒精擦拭室内培养的烟草叶片，直接接入培养瓶竟然没被污染，愈伤长势非常好。有些马铃薯、胡萝卜自身带菌的情况比较多，外购时很难用肉眼辨别，一旦消毒杀菌不彻底，即使实验操作不污染也易死亡。例如做马铃薯块茎、胡萝卜形成层培养实验，买回看起来很干净健康的原材料，尽管接种后无污染，也有的褐化、死亡现象。分析原因可能是由于材料自身带菌，造成实验失败。月季茎段枝条有毛刺、风雨泥土污染严重，做月季茎段培养，即使选用幼嫩枝条也很难消毒，需要用毒性较高的升汞消毒20 min以上才能彻底消毒。所以，针对外植体选择合适的消毒剂和消毒时间非常关键。多数植物外植体按照实验要求和步骤对其进行表面消毒即可。一般用质量分数75%的酒精消毒 30～60 min；2%～5%的次氯酸钠溶液消毒 8～15 min，无菌水冲洗五六次即可接种，而有些外植体由于结构复杂或自带内生菌,为达到较好的灭菌效果，除需要进行表面消毒外还需要其他增强措施，如抽滤灭菌、添加抗生素、使用多种消毒剂、延长消毒时间等。但是时间并非越长越好，消毒剂并非越强越好，组培实验既要注意防止材料受药害，也要防止人身受毒害。

3 学生在实验操作中存在的问题

材料选择固然重要，但是每次实验的核心工作是学生的操作。操作过程中个人卫生差、操作不规范、接种工具消毒不彻底、材料选择不当，都会导致实验失败，影响后续实验正常进行，对连续性综合性实验是最大的障碍。

学生实验中常见现象有未穿工作服直接闯入接种室；手未消毒直接伸进超净台，或实验中途将手伸出超净台拿工具入超净台；接种工具枪镊子、解剖刀、剪刀、解刨针等器具在酒精灯上灼烧消毒后，未待冷却就接种，烫伤实验材料；也有些人实验步骤不熟悉，操作程序颠倒，操作缺乏经验等等，这些都是导致实验失败的直接原因。无菌操作者的基本要求是个人卫生良好，身穿工作服，带着手套进行实验。但本科生实验多数情况下是不带手套的，因此，操作前必须自行消毒，用质量分数75%酒精消毒双手和工作服袖口及正对超净台的前襟。双手一旦伸进的超净台后，不能随意出来，否则就要重新消毒。即使带了手套，也不能随意接触其他物品后不更换、不消毒就去做组织培养实验。例如，有同学做土壤微生物实验带着手套，未消毒换手套又来做组培接种，结果其培养瓶中长满黑毛，细菌污染相当严重。

对植物组织与细胞培养实验，无菌操作技术和经验积累都是关键因素[6]。技术娴熟的同学，无菌操作规范，接种不易污染，实验易成功。初次实验的同学，虽然小心翼翼，也容易做不好，实验污染率比有经验的同学高两倍。学生初次配培养基经常出现不凝固，接种出现污染现象就是缺少经验，pH值未调好、无菌操作未掌握的原因。所以，在实验准备良好的情况下，学生的操作技能在整个实验教学中起着决定性作用，直接关系到实验的成败。

4 针对实验中的问题采取有效措施

在控制《植物组织与细胞培养》实验主要影响因素及提高学生实验技能方面，采取积极有效的措施予以应对。

首先，持之以恒地搞好日常维护，抑制环境污染。日常清洁、酒精、巴斯消毒必不可少。夏季气温较高环境污染严重时，还需要用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸实验室，为接种室和培养室杀菌，保持组织培养实验室洁净无菌；对平时实验失败污染的培养瓶、培养皿等器具，严禁在实验室内直接打开，必须经高压灭菌后，倒掉污染的培养基及外植体，然后再清洗干燥，防止真菌孢子在实验室飞舞蔓延，对以后实验环境造成二次污染[7]。对超净台，除了日常消毒，经常检测操作区带菌量，定期清洗超净台抽滤网，达不到要求的及时更换，一般每3年更换1次。其他设备如培养箱、培养架、摇床、离心机等设备，实验前严格用沸水、巴斯消毒液、酒精擦洗消毒，以防无菌操作无误却在培养过程中造成失误，营造植物组织细胞分化、再生的良好环境。

其次，在材料准备方面下功夫，认真准备实验材料，为减少大田取材污染重的影响，用于本科实验教学的大部分实验材料由实验人员亲自在室内种植，在植物生长最旺盛阶段，选择最健壮、最适合的部位作为培养对象；对于外来材料严格挑选，预培养检测其是否自身带病毒，保证选出优质的实验材料，尽量降低实验材料自身带菌导致的实验失败，尽可能让学生在有限的时间内掌握更多实验技能。同时还要及时总结经验，调整消毒方法，提高实验成功率。如小麦成熟胚培养实验是农学学生必做的实验，也是学生操作下最不易成功的实验，灭菌不彻底是主要因素。浸泡种子前反复淘洗、抽真空减压消毒，再用双氧水冲洗，之后用无菌水加2,4-D浸泡，接种前延长酒精和次氯酸钠的消毒时间，增强灭菌效果，保证每次实验成功有效。

再次，建立无菌植株系统[8-9]，选择烟草、油菜、马铃薯等作物，在培养箱中培养，取其叶或茎，从愈伤诱导—丛生芽分化—生根培养—炼苗移栽四大步，连续做综合实验。选择上一实验的结果为下一实验提供材料，系统性地完成植物组织培养实验的全过程，主动降低实验过程的污染率，提高操作效率。

最后，努力提高学生的实验技能和实践水平。要求学生提前熟悉无菌操作规程及每个实验的基本技术环节；实验前反复认真观看教师针对实验制作的操作视频和现场演示；动手操作时仔细观察接种物结构特点，规范消毒，严格按步骤操作；培养阶段要求学生3 d观察一次，及时记录外植体的变化；认真分析实验结果，总结成功经验、分析失败原因。精心安排实验进展。针对32课时的实践操作课程，先上单一性验证性实验，让同学们先训练基本技能，熟练掌握无菌操作技术，再进行综合性、创新性连续性实验操作，渐进式学习实践，进一步提高学生的实验技术水平。这样经过反复体会、训练，练就娴熟的技能，积累丰富的实验经验，获得理想的实验结果和良好的教学效果。

5 结束语

虽然影响《植物组织与细胞培养》实验的因素较多，但多数都是可以控制的。同学们通过学习实践再学习，真正精湛地掌握了植物组织与细胞培养这门专业技能，能够独立判断分析实验成败的原因，并能有效控制、清除实验污染，培育出再生植株，为今后严谨的科研工作和生产实践打下良好的基础。实验教学效果良好，得到老师、同学和就业单位的好评。