3个柑橘品种幼苗对低温胁迫的生理响应及其抗寒性评价*

阳 妮，蒋景龙，李 丽，侯茹平，丁德宽，邓家锐

（1陕西理工大学生物科学与工程学院，汉中723001）（2陕西理工大学化学与环境科学学院）（3城固县果业技术指导站）

柑橘属芸香科（Rutaceae）多年生植物，喜暖畏寒，分布于北纬16～37°，是世界第一大类水果[1]。根据《中国农业统计资料》显示，自2007年以来，我国柑橘面积和产量均居世界首位，至2017年种植面积已达到17.8万hm2，产量3 853.32万t[2]。陕西省南部是我国柑橘最北缘的种植区，具有独特的生态和气候条件，柑橘种植历史悠久，目前柑橘产业已成为陕南地区的主导产业之一，也是农民脱贫致富的重要途径[3]。

冻害是影响我国柑橘生产的主要因素之一，陕南地区因处于柑橘栽培的北部边缘，冬季易发生冻害[4]。据调查，陕南地区曾出现过6次（1955、1967、1975、1991、2012、2016年）严重的柑橘冻害，2016年出现-11～-7 ℃的极端天气，低温持续时间超过20 d，造成了严重的经济损失[5]。因此，如何提高柑橘的抗寒性，筛选出抗寒品种在柑橘生产中显得至关重要。马文涛等[6]以贵州3个野生柑橘品种和1个栽培品种的枝条为试材，在4、0、-5、-10、-15、-20、-25 ℃下各处理24 h，检测了丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性等指标，并利用隶属函数法分析得到抗寒性由强到弱依次为‘宜昌橙’>‘酸橙’＞‘白黎檬’＞‘默科特’。蒋景龙等[7]以汉中地区3个柑橘主栽品种为试材进行低温处理，并通过隶属函数法和主成分分析最终得出‘日南1号’抗寒能力最强，在各项指标中相对电导率和丙二醛含量具有较强的代表性。侯茹平等[8]选择3个柑橘砧木品种在-7 ℃下处理36 h，分析了低温胁迫下柑橘的形态、植株和叶片的鲜重和干重等指标，并运用隶属函数法进行了综合性分析，结果表明‘枳壳’抗冻能力最强，可在陕南地区推广。因此，生理指标测定和隶属函数法已成为评价柑橘抗寒性的重要途径和有效方法。

‘砂糖橘’在陕南地区引进栽培，不仅能丰富当地柑橘品种，还能促进经济和农业的发展。‘砂糖橘’主要分布于广东、广西等地，具有稳产、丰产的特点，因其味甜汁多深受人们欢迎，但其在陕南地区的抗寒性尚不清楚。‘冰糖橘’和‘朱红橘’是城固县地方特色品种，经长期筛选和栽培发展而来，与温州蜜柑类相比抗寒性较强，适应性广，较晚熟。因此，本研究以城固地方特色品种‘冰糖橘’和‘朱红橘’以及引进品种‘砂糖橘’的幼苗为试验材料，研究在-2 ℃处理1～6 d后的植株形态、细胞膜损伤、光合特性指标、渗透调节物质和抗氧化系统的变化，并利用隶属函数法和主成分分析对各项指标进行分析，旨在综合比较3个柑橘品种的抗寒能力，并筛选评价抗寒性的最有效生理指标，为进一步研究不同柑橘品种对低温胁迫的响应机理奠定基础，同时也期望为陕南地区柑橘良种的选育、引种及栽培提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的培养与处理

供试材料‘冰糖橘’‘朱红橘’和‘砂糖橘’的果实采自汉中市城固县果业技术指导站的陕南柑橘综合试验站。首先，剥取并统计果实内的种子，然后配制浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液，浸泡种子15 min，再用清水清洗30 min，置于稀释了3倍的5%次氯酸钠消毒液中20 min，沥出后将种子皮用镊子剥除，放于加满蒸馏水的玻璃培养皿（底部平铺滤纸）中，将培养皿放于24～28 ℃的培养箱中催芽。最后将发芽的种子移至富含营养土的32孔穴盘中，待种子出土发芽长至2片小叶时，移至苗盆中继续生长至10～12片真叶，选取大小一致、长势相同的幼苗置于改装的低温冰柜中进行低温处理，温度设置为-2 ℃，光照强度为4 000 lx，光照周期为16 h/8 h（白天/夜间），低温冰箱以每小时降低2 ℃的速度降至-2 ℃。分别在低温处理后1、2、3、4、5、6 d时进行形态学观察和拍照，然后采集叶片，迅速冻于液氮中后放置于-80 ℃冰箱，用于测定各项生理指标，3株为1个处理，每个处理设3次重复。

1.2 生理指标的测定

（1）相对含水量的测定参照Pradhan等[9]的方法。

相对含水量（%）=［（鲜重-干重）/（饱和鲜重-干重）］×100

（2）相对电导率的测定。采用电导率仪DDSJ-308F测定[10]，相对电导率（%）＝（R1/R2）×100，R1表示室温浸泡12 h所测的电导率，R2表示沸水浴30 min所测的电导率。

（3）丙二醛含量的测定。参照Sheng等[11]的方法，使用5%三氯乙酸溶液提取叶片中的丙二醛，在提取液中加入0.6%硫代巴比妥酸溶液进行显色反应，水浴中煮沸20 min，以蒸馏水为空白在450、532、600 nm处测定吸光度值，根据以下公式计算丙二醛含量。

丙二醛含量（nmol/g）=［6.45×（A532-A600）-0.56A450］×Vt/（Vs×W）

其中Vt表示提取液总体积（mL），Vs表示测定用提取液体积（mL），W表示样品鲜重（g）。

（4）光合特性指标的测定。叶绿素荧光参数利用OS-30P+荧光仪，选取柑橘幼苗的第5～7片真叶，用夹子夹住暗适应20 min，后将其暗反应部位暴露于660 nm固态光源下1 min，测出Fv/Fm[12]。叶绿素含量参照Mostofa等[13]的方法，有改动，取混合均匀的柑橘叶片置于离心管中，加入10 mL 80%丙酮，避光放置24～36 h至叶片变白，测定663、646、470 nm处的吸光度，对照为80%丙酮，计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素（叶绿素a＋叶绿素b）、类胡萝卜素含量。

叶绿素a含量（Ca）=12.21D663-2.81D646

叶绿素b含量（Cb）=20.13D646-5.03D663

类胡萝卜素含量（Cxc）=（1 000D470-3.27Ca-104Cb）/229

（5）渗透调节物质的测定。采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[14]，脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮法[13]。

（6）抗氧化物质的测定。抗坏血酸和还原型谷胱甘肽含量的测定参照文献［15］，过氧化氢酶活性测定参照Jiang等[16]的方法，过氧化物酶活性测定采用愈创木酚法[14]。

1.3 隶属函数和主成分分析

采用徐舒等[17]的隶属函数法对3个柑橘品种的抗寒性进行综合评价，隶属函数公式为：R（Xi）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin），Xi为指标测定值（i=1，2，3，4……n），Xmin、Xmax分别为某指标的最小值和最大值。主成分分析各项生理指标参照杜培兵等[18]的方法。

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 2010、SPSS 22.0软件进行统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对柑橘幼苗形态的影响

3个柑橘品种植株表型变化特征如图版3所示，对照（低温胁迫0 d）植株生长正常，未出现任何症状。在处理第1～2 d时，‘冰糖橘’和‘砂糖橘’的植株上部嫩叶均出现萎蔫症状，其中‘砂糖橘’萎蔫较严重，而‘朱红橘’植株外观长势无明显变化；处理第3～4 d时，‘冰糖橘’和‘砂糖橘’的叶片大部分萎蔫，部分叶片出现失水现象，‘朱红橘’上部嫩叶相继出现萎蔫症状；处理第5～6 d时，植株的受害症状加重，其中以‘砂糖橘’较为严重，其次是‘冰糖橘’，‘朱红橘’仅顶端叶片有较明显伤害。

2.2 低温胁迫对柑橘幼苗叶片细胞膜损伤的影响

由图1-A可以看出，3个柑橘品种幼苗叶片相对含水量经胁迫处理后均呈逐渐下降的趋势，其中‘砂糖橘’于处理第4 d最先达到最小值，较对照（低温胁迫0 d）降低了48.29%，而‘冰糖橘’‘朱红橘’处于缓慢降低的趋势，于处理第6 d降至最低。

低温胁迫下，3个柑橘品种幼苗叶片相对电导率均呈逐渐升高的趋势（图1-B），均在处理结束时达到最高值，分别较其对照增长了168.65%、115.11%、220.34%，差异均达显著水平，说明低温胁迫使细胞膜通透性增加，电解质泄露。

如图1-C所示，‘冰糖橘’‘朱红橘’丙二醛含量均呈先降低后升高的趋势，均在处理第1 d下降至最低，从第2 d时开始增加；而‘砂糖橘’的丙二醛含量则呈逐渐升高的趋势。至胁迫结束时，3个柑橘品种分别较对照增加了45.73%、23.81%、58.95%，差异均达显著水平。

图1 低温胁迫下3个柑橘品种幼苗细胞膜损伤的变化

2.3 低温胁迫对柑橘幼苗叶片光合特性的影响

Fv/Fm是PSⅡ最大光能转换效率。由图2-A可以看出，‘冰糖橘’‘朱红橘’和‘砂糖橘’3个柑橘品种幼苗叶片Fv/Fm均随胁迫时间的延长而降低，至胁迫结束时分别较对照降低了60.38%、68.00%、78.37%，差异均达显著水平。如图2-B、C所示，3个柑橘品种的总叶绿素含量、类胡萝卜素含量均在处理第1～3 d降低，并在处理第3 d达到最低值，均以‘冰糖橘’变化幅度最大，与对照相比分别降低了37.91%、34.12%。由于处理温度并没有完全破坏光合色素合成，使3个柑橘品种的总叶绿素、类胡萝卜素含量在处理第4～5 d又出现了不同程度的升高，因此，光合色素含量整体表现出先下降后升高的趋势。

图2 低温胁迫下3个柑橘品种幼苗叶绿荧光参数和叶绿素含量的变化

2.4 低温胁迫对柑橘幼苗叶片渗透调节物质的影响

如图3-A所示，低温胁迫下，‘冰糖橘’的可溶性糖含量呈S形曲线增加；而‘朱红橘’和‘砂糖橘’则呈先降低后升高的趋势，二者在处理第1 d时与对照相比显著降低了27.01%、29.48%，之后其可溶性糖含量随着胁迫时间的延长而升高。处理第6 d，‘冰糖橘’‘朱红橘’和‘砂糖橘’的可溶性糖含量均达最高，分别较对照增加了97.97%、75.84%、107.42%，差异均达显著水平。‘冰糖橘’和‘朱红橘’的脯氨酸含量均呈先下降后上升的趋势，在处理第1 d略有降低，后逐渐上升，而‘砂糖橘’呈逐渐上升的趋势。与对照相比，‘朱红橘’的脯氨酸含量增幅最大，达120.87%（图3-B）。

图3 低温胁迫下3个柑橘品种幼苗渗透调节物质的变化

2.5 低温胁迫对柑橘幼苗叶片抗氧化系统的影响

在低温胁迫下，3个柑橘品种幼苗叶片抗坏血酸、还原型谷胱甘肽含量总体均呈下降趋势（图4-A、B），相比于抗坏血酸含量的变化，还原型谷胱甘肽含量整体变化幅度较小。处理第1 d，3个柑橘品种叶片抗坏血酸含量均显著降低，而还原型谷胱甘肽含量仅‘冰糖橘’出现显著降低，在处理结束时，与对照相比，‘冰糖橘’‘朱红橘’和‘砂糖橘’的抗坏血酸含量分别降低了67.81%、69.69%、68.42%，还原型谷胱甘肽含量分别降低了5.74%、1.47%、4.67%。

如图4-C所示，3个柑橘品种的过氧化氢酶活性均呈下降趋势。处理第1 d，‘砂糖橘’的过氧化氢酶活性显著降低，而‘冰糖橘’和‘朱红橘’的过氧化氢酶活性升高，于处理第2 d开始降低。当胁迫持续至第6 d时，‘砂糖橘’的降幅最大，为29.10%，‘朱红橘’次之，‘冰糖橘’降幅最小。

由图4-D可以看出，‘砂糖橘’的过氧化物酶活性在处理第4 d有显著上升，后呈下降趋势，说明在处理第4 d酶抵御胁迫的能力达最大，之后酶活性逐渐减小。而‘冰糖橘’和‘朱红橘’的过氧化物酶活性整体呈逐渐增加的趋势，在处理第6 d时分别较对照增加了24.39%、53.65%，差异均达显著水平。

图4 低温胁迫下3个柑橘品种幼苗抗氧化系统的变化

2.6 柑橘幼苗叶片的综合比较与主成分分析

采用隶属函数法对3个柑橘品种幼苗叶片的抗寒性进行综合性评价，通过计算各项生理指标的隶属函数值，得到平均隶属函数值，平均隶属函数值越高，抗寒性越强。结果如表1所示，平均隶属函数值以‘朱红橘’最大（0.486），其次是‘冰糖橘’（0.447），‘砂糖橘’最小（0.436），所以3个柑橘品种幼苗叶片的抗寒性由强到弱依次为‘朱红橘’＞‘冰糖橘’＞‘砂糖橘’。

表1 低温胁迫下3个柑橘品种幼苗生理指标的隶属函数值

使用SPSS 22.0软件对3个柑橘品种的12个生理指标进行主成分分析。如表2所示，仅提取特征值大于1的主成分，前2个主成分特征值大于1，方差贡献率分别为67.894%、32.106%，累积贡献率超过85%，说明前2个主成分能够较好地代替上述12个生理指标来评价柑橘的抗寒性。

表2 主成分的特征值及贡献率

根据表3可知，决定第1主成分的主要是相对电导率、相对含水量、可溶性糖含量，决定第2主成分的主要是过氧化氢酶活性。

3 讨论与结论

叶片是植物进行光合作用和蒸腾作用的主要部位，当植物受到胁迫时，叶片会出现卷曲、枯萎、脱水等现象[19]。形态特征的变化是植物受到伤害的直观表象，因此可根据这些现象对植株进行抗寒性评价[20]。本研究结果显示，低温胁迫对‘砂糖橘’伤害最严重，其次是‘冰糖橘’，‘朱红橘’仅顶端叶片受到明显伤害，说明抗寒性强，与隶属函数法值结果一致。

表3 主成分的载荷矩阵

相对含水量是衡量植物含水量的重要指标，在胁迫条件下，植物内的相对含水量随着胁迫程度的增加而降低[21]。本研究结果显示，3个柑橘品种幼苗叶片相对含水量在低温胁迫下均呈逐渐降低趋势，其中‘砂糖橘’最先达到最小值，表明‘砂糖橘’受低温胁迫严重，保水能力较差。‘冰糖橘’与‘朱红橘’在处理第5、6 d时略有回升，这可能与蒸腾作用减少有关，该结果与简营等[22]研究结果一致。

植物在遭受逆境胁迫时，细胞膜的完整性会被破坏，导致细胞内电解液发生泄露[23]。有研究报道，在低温胁迫下，抗寒能力越弱的植物细胞膜透性越大，相对电导率就越高[24]。在本研究中，3个柑橘品种的相对电导率均呈上升趋势，其中以‘砂糖橘’上升幅度最大，‘朱红橘’最小，表明低温胁迫使柑橘叶片的细胞膜结构受到了不同程度的损害。丙二醛是植物响应外界变化而进行膜脂过氧化的产物，对细胞有毒性[25]。令凡等[26]对不同油橄榄品种在温度胁迫下的生理响应研究表明，植物的抗寒能力与丙二醛含量呈负相关，即抗寒能力越弱，丙二醛含量越高。本研究中，3个柑橘品种的丙二醛含量均呈逐渐升高的趋势，说明低温胁迫使柑橘植株遭受到损害，且‘砂糖橘’的变化幅度最大，说明过氧化程度最大，表现出较弱的抗寒能力。

光合作用是植物生存的基础，逆境对光合作用产生的影响可通过叶绿荧光参数反映出来，Fv/Fm就是其中重要的参数，与衡量植株受胁迫损害程度密切相关[27]。在本研究中，3个柑橘品种幼苗叶片Fv/Fm均随胁迫时间的延长逐渐降低，说明光反应中心受到了低温胁迫的损害，导致光能转化能力下降，该结果与周建等[28]的研究一致。叶绿素是植物细胞内参与光合作用的重要色素，朱鹏锦等[29]研究低温对4个甘蔗品种叶片光合生理特性的影响中发现，各品种在低温下的叶绿素含量也相应下降，且耐寒性强的品种叶绿素含量比耐寒性弱的品种高。但在本研究中，3个柑橘品种幼苗叶片叶绿素含量均出现先降低后升高的现象，如侯祯丹等[30]所述，这可能是由于在胁迫处理前期柑橘幼苗叶片光合作用降低，叶绿素合成受制，导致叶绿素含量降低，但处理温度没有完全破坏叶绿素合成，随着胁迫时间的延长又出现了不同程度的增高。

植物可通过渗透调节物质来调节体内细胞液浓度以适应外界环境的变化，可溶性糖和脯氨酸作为植物体内重要的渗透调节物质，可降低细胞水势，增加细胞稳定性，与抗逆性密切相关[31]。本研究中，3个柑橘品种叶片可溶性糖含量和脯氨酸含量，在低温胁迫下均表现出不同程度的增加，体现了3个柑橘品种为抵抗低温胁迫，主动生成调节物质以适应环境的改变。马英等[32]研究表明，耐冷性强的植物产生的脯氨酸含量高于耐冷性弱的植物，在本研究中‘朱红橘’的脯氨酸含量变化幅度最大，增长量最多，说明具有较强的抗寒能力。

植物受到外界胁迫时，可通过抗氧化系统来维持体内活性氧的平衡，减轻胁迫造成的伤害，保证植株生长发育[33]。抗氧化系统包括2个方面，一是抗氧化物质，如抗坏血酸、还原型谷胱甘肽，可通过AsA-GSH循环清除H2O2；二是抗氧化酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶，可直接把H2O2分解为H2O和O2，从而降低活性氧对植物的伤害[34]。本研究中，3种柑橘叶片的抗坏血酸含量和还原型谷胱甘肽含量均呈下降趋势，这意味着低温胁迫在一定程度上破坏了柑橘的防御系统，活性氧积累增加，是其受低温伤害的重要原因之一，但还原型谷胱甘肽含量的变化幅度总体不大，且在低温胁迫后的含量均高于抗坏血酸含量，说明在受到胁迫后，3个柑橘品种的还原型谷胱甘肽清除活性氧的能力强于抗坏血酸，这一结果与孔广红等[35]研究结论一致。在酶的测定中，胁迫处理均导致过氧化氢酶和过氧化物酶活性变化，说明柑橘幼苗叶片通过提高抗氧化酶活性来清除体内的活性氧，改善胁迫带来的损害，但胁迫的加剧超出了植物自身的承受范围，酶活性则会下降，下降程度越大，受损害越严重，这与李桂荣等[36]研究结果一致。

本试验利用隶属函数法综合评价了3个柑橘品种的抗寒性，‘朱红橘’的抗寒性最强，‘砂糖橘’最弱，表明柑橘抗寒性与地理分布密切有关，低纬度地区植物耐低温能力低于高纬度地区植物，这一现象在油茶[19]的研究中也有反映。另一方面，‘砂糖橘’在种植过程中长时间抵御低温的能力弱，易受低温天气的影响，因此在冬季应及时做好防冻保护措施，避免造成巨大的经济损失。同时主成分分析表明，相对电导率、相对含水量、可溶性糖含量和过氧化氢酶活性可作为柑橘抗寒性分析的重要指标，其中相对电导率代表性最强，可为研究柑橘和实生苗等方面提供一些参考。本研究结果不仅为筛选柑橘抗寒性品种提供了理论支持，在今后柑橘的生产和栽培中有重要意义，还为进一步研究柑橘在低温胁迫下的生理机制提供了依据，但抗冻性不同的柑橘品种间的分子水平差异，还有待进一步探究。