从物质分离到微流控芯片技术

刘闪闪，魏钊阳,陈砚美，甘喜武，付 军，张万举

(1. 黄冈师范学院 化学化工学院，湖北 黄冈 438000; 2. 黄冈市教育局，湖北 黄冈 438000； 3. 湖北省黄冈中学，湖北 黄冈 438000)

物质的纯度是反映物质品质的一个重要指标，例如生活中离不开的食用级食盐、实验室中的分析纯化学药品、治病所用的医学药品及生产计算机芯片所需的高纯硅等都对物质的纯度有很高要求，因此研究物质的分离提纯方法具有重要的现实意义。基于物质的物理性质及生化性质的差异对目标物进行分离提纯是中学化学科学实验探究活动中的一个重要指导思想，具体的一些分离提纯操作包括过滤、渗析、结晶、萃取、蒸馏等。利用过滤操作，我们可以提纯含有少量泥沙的粗盐；利用重结晶，我们可以分离含有少量氯化钾的硝酸钾粉末；利用萃取操作，我们可以提取碘水中的碘等。在氢氧化铁胶体的制备实验中，当我们想要除去氢氧化铁胶体中的未完全反应的氯离子时，可以通过渗析操作，利用半透膜对氯离子的选择性透过，达到净化提纯胶体的目的。那如果想要除去一名肾功能恶化的尿毒症患者的血液中的代谢废物，可以采取什么办法呢？血液透析！血液透析就是利用渗析的原理，将血液看做胶体，将血液中的代谢废物和电解质看做可以透过半透膜的小分子或离子，通过渗析操作，将代谢废物分离并清除，从而发挥人工肾脏的作用。由此可见，我们看似简单的化学知识却能发挥治病救人的大本领，为人们的生命健康做出重要贡献。

提到生命健康，恶性肿瘤总是一个绕不开的话题。在癌症治疗过程中，肿瘤的复发和转移是最常见的标志病情恶化的医学现象，这个现象与循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)有密切关系。CTCs是从原发肿瘤或转移肿瘤脱离并进入到外周血的肿瘤细胞，是主要的癌症标志物之一[1-2]。而且，CTC的检测仅需抽取几毫升血液，检测方便、无创，成为诊断肿瘤发生及转移最直接和重要的方法。但是存在于外周血中的CTCs个数极少，每105～107个血细胞仅含有一个CTC[3-4]，且经历了上皮间质转化的CTCs表型蛋白种类复杂、生命力及转移能力极强，这些特征严重限制了CTCs的识别、富集及检测。因此，亟待发展准确率高的低丰度CTCs分选富集新方法。那么，如何分离富集外周血样品中的低丰度循环肿瘤细胞呢？从中学学习的物质分离方法可以找到答案吗？过滤！我们把外周血看做氯化钠溶液，将外周血中含有的极少个数的CTCs看做泥沙，利用他们尺寸大小的差异达到分离的目的。但是，泥沙肉眼可见，而CTCs的尺寸只有几十微米，并且，我们还需要对收集到的细胞进行形态分析、蛋白质组化信息收集、耐药性研究等后续操作。单纯用简单的过滤装置无法满足我们的需求，因此，科学家们发展了诸多分离纯化技术并应用于生命体系中杂志物质的有效分离和疾病标志物的富集检测，如构建微流控芯片分离富集癌症病人外周血样品中的低含量循环肿瘤细胞。

微流控芯片的概念起源于1990年瑞士科学家提出的微全分析系统，是一种在微米级尺度上对微量流体进行分析和处理的技术。微流控芯片以生化分析为基础，依托微机电加工技术和微管道网络结构，实现在微小芯片上完成采样、稀释、反应及检测等常规生化实验[5]。相比较于传统的物质分离富集方法，微流控芯片具有微型化、集成化、自动化及高效率等优点，在分析化学、生命科学、临床医学、药物筛选、食品分析、司法鉴定等领域引起了广泛的关注。自2015年美国总统奥巴马提出“精准医疗计划”后，微流控芯片在生命科学领域尤其是细胞富集检测的应用研究得到了更广泛的推广。

1 基于微流控芯片的细胞富集分离方法

研究物质性质，探究反应规律，基于此选择物质分离检测方法。因此，高效分离富集CTCs离不开对其理化性质的深度了解。研究对象CTCs与其共存物的主要差异包括两大方面，物理性质和生化性质。物理性质的主要差异是CTCs比其他共存细胞如红细胞、白细胞、血小板等的尺寸大，其他密度、力学、介电性质、变形性都有差异。因此根据物理性质的差异，选择物质分离实验方法，进而具体设计实验方案，探究实验结果。除了物理方法之外，掌握CTCs与正常细胞的生化性质差异也可利于发展新的分离富集方法。相比于正常细胞，CTCs细胞膜表面表达大量的上表皮粘附因子及细胞角蛋白等抗原，而正常细胞则不表达这些抗原。抗原与抗体可以特异性识别，利用这种差异，在过滤装置中引入抗体，CTCs就可被抗体牢牢抓住，其他细胞顺利通过芯片通道，从而达到与其他细胞正常分离以及富集CTCs的目的。

2 基于物理性质差异的分离法

含有循环肿瘤细胞的外周血样品的主要成分包括红细胞、白细胞、血小板和少量CTCs。CTCs的细胞直径为13～25 μm，比红细胞、白细胞及血小板的体积大，因此可基于细胞尺寸的差异，通过在微流控芯片上设计孔径合适的过滤装置达到分离富集的效果[6]，实现低成本、快速、简便的高通量检测方法。

Chen等[7]基于PDMS利用光刻蚀技术设计直径大约18～22 μm, 深度5～8 μm的三维孔洞结构的微流控芯片分离富集外周血样品中的循环肿瘤细胞。但是，体积较小的干扰共存物在重力及涡旋外力的作用下有较大可能优先占据孔洞，从而导致了目标细胞的流失，得到较低纯度的目标细胞样品。为了避免目标细胞的流失，Tan等[8]构建月牙形微阵列模式，月牙错位排列，留出5 μm宽度缝隙，从而有效截留大体积的目标CTCs细胞。由于外周血样品中同样存在个别体积较大的白细胞等，因此该方法截留的目标细胞样品纯度也会受到影响。此外，基于细胞尺寸大小的多数过滤式微流控芯片在工作过程中会由于滤膜堵塞及流动压力而破坏细胞活性，进而影响后续分析。

Zhou等[9]构建双层过滤芯片(图1)，精细设计孔洞大小、排列间距及层间隙，使得小体积的白细胞、红细胞等物质通过小规格孔洞进入层间隙，从而与大体积循环肿瘤细胞分离，层间空隙的存在极大的减小了芯片中通过的液体缩产生的压力，进而有效保护截留的循环肿瘤细胞的活性。

图1 微流控芯片装置横切图及单元模型三维视图Fig. 1 Crosscutting diagram of microfluidic chip device and three-dimensional view of unit model

Loutherback等[10]基于流体力学设计了确定性侧向位移芯片(图2)，在左侧入口处注入外周血样品，各成分沿通道从左向右移动，在移动过程中，不同尺寸的细胞受到的阻力和侧向位移力不同。在这些力的综合作用下，较大体积的细胞横向移动到通道一侧，较小体积的红细胞及白细胞沿着流体方向正常移动，最终实现分离富集CTCs的目的。此外，利用不同成分的介电常数性质的差异，在外电场作用下也可以实现CTCs的分离富集。

图2 基于确定性侧向位移构建微流控芯片原理图Fig. 2 Schematic diagram of microfluidic chip based on deterministic lateral displacement

上述这些工作都是利用CTCs的物理性质差异进行分离富集，但是通过对实验过程的把控和得到的结果的分析对比，总结出了利用物理性质差异进行分离的两个固有缺点：一是外周血样品中存在的白细胞往往体积也较大，其细胞直径范围与CTCs常有重叠，因此仅通过细胞尺寸大小差异设计芯片截留的细胞样品纯度难以保证；二是CTCs 的变形性大，在外力作用下极有可能发生变形从而通过小孔道流失，造成假阴性结果。基于上述结果的分析讨论，我们可以得出结论，单纯利用物理性质差异分离富集的效果有待提高。为了提高分离的准确率和收集的细胞样品纯度，我们需要在过滤装置中锚定具有特异性识别和捕获能力的物质，利用细胞表面表达蛋白的特殊性进行分选。

3 基于生物性质的亲和分离法

从肿瘤组织脱落而进入到外周血的循环肿瘤细胞与正常细胞相比，细胞膜表面表达较多的上表皮粘附因子(Epithelial Cellular Adhesion Molecule, EpCAM)，外周血中白细胞表现CD45高表达[11]，因此可基于这些标志物的表达差异对CTCs进行有效分选。

Adams等[12]利用修饰了羧酸基团的甲基丙烯酸甲酯制备表面粗糙的芯片基底，通过酰胺缩合反应连接anti-EpCAM抗体制备高通量微流控芯片，当外周血样品经过微流控芯片时，芯片上修饰的anti-EpCAM抗体与液体样品中表达了EpCAM抗原的细胞识别并结合，从而实现对肿瘤细胞的分选富集。该法的细胞分离效果明显高于单纯利用细胞尺寸差异的分离方法，但外周血样品流经芯片时，受外力作用，部分细胞会处于中流层更甚者于上层，处于中流层及上流层的细胞将难以于芯片上的抗体接触，无法被芯片表面抗体顺利捕获，这将显著降低CTCs的回收率。为了提高捕获率，Wang等[13]利用氢氟酸刻蚀工艺制备硅纳米孔基底，在硅纳米柱上修饰anti-EpCAM抗体，增加抗体与细胞的接触机率，从而达到分选富集的目的。相比较于平板硅片基底，该方法中的纳米柱基底对细胞的捕获效率增加了十倍左右。Stoot[14]等构建鱼骨形芯片，利用非对称通道及非均匀深度沟壑产生的涡流增加细胞与抗体的接触机率，达到93%的回收率。

利用细胞表面的EpCAM与芯片修饰的抗体的特异性识别进行实际样品检测时，通常会存在假阴性现象。由于肿瘤细胞在入侵血管和淋巴系统时，会经历上皮-间叶转换(Epithelial Mesenchymal Transitions，EMT)过程，使得细胞表面的上皮组织标志物下调或者缺失，取而代之的是更多表达间叶组织标志物，因此单纯利用EpCAM与抗体识别作用的捕获效果严重受限。为了解决这一现实问题，研究学者们巧妙利用了核酸适配体设计微流控芯片。核酸适配体(Aptamer)是一种具有高亲和力可特异性识别目标物的寡核苷酸单链，它具有合成简单、性质稳定、与目标物结合力强的优点。Sheng 等[15]在微流控芯片通道中连接修饰了核酸适配体的金纳米颗粒用于捕获CTCs, 得到了高于90%的分选富集效率。Sheng等[16]在含有59000个以上的微米柱的基底材料上修饰核酸适配体捕获CTCs，目的细胞的捕获率达到95%(图3)。

图3 基于核酸适配体的微流控芯片的构建Fig. 3 Schematic diagram of microfluidic chip based on aptamer

微流控芯片在分离富集及检测外周血中循环肿瘤细胞方面发挥着重要的作用，这也已经成为检测循环肿瘤细胞的最可靠方法之一。微流控芯片是一种重要的新一代生物医学技术，特别是在生物传感、药物筛选、组织工程、人体器官修复、靶向治疗等领域发挥越来越大的作用。

4 总结与展望

循环肿瘤细胞的分离富集对癌症的无痛检测、预后分析和个性化治疗具有重要意义。结合循环肿瘤细胞的理化性质和分离纯化技术，本文列举了微流控芯片在循环肿瘤细胞分选富集方面的突出成果及研究进展。微流控芯片如同一个根据目标物的特殊性质而设计的结构精细、功能多样化的微量自动化过滤装置，科研工作者们从问题出发，分析目标物的理化性质，基于此对微流控芯片进行的巧妙设计，从而在人类生产、生活和生命医学研究中发挥更大作用，推动化学科学在人类健康方面展现重要价值。