昆虫化学感受蛋白研究进展

刘孝贺，孙丽娜，张怀江，仇贵生

（中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城 125100）

0 引言

随着环境污染的日益严重，高毒高残留的农药被限制使用，以及害虫的抗药性逐渐增强，所以找到一种环保、高效、低成本的防治害虫的方法，对环境保护有着重要的意义[1]。因此，对害虫研究的热点集中在昆虫嗅觉相关蛋白OBPs 和CSPs，希望能够利用性信息素干扰昆虫的交配，从而降低虫口密度，达到田间防治的效果。

昆虫对气味分子的识别具有稳定性、灵敏性和专一性的特点。该识别过程主要分为两个阶段：首先在外周神经水平上，气味分子通过昆虫感器上密布的极孔进入到昆虫的淋巴液中。气味分子一般是疏水性的小分子物质，运送到嗅觉神经元(Olfactory Sensory Neurons,OSNs)激活信号受体，这时需要气味结合蛋白与气味分子结合并将其运送穿过亲水性的淋巴液，气味分子激活神经元上的信号受体。此时，化学信号转变为神经冲动在神经元上进行传递。其次信号传递到中枢神经系统，中枢神经对信号进行整合和加工指导昆虫的行为[2]。在这个过程中，需要多种蛋白的相互协作，如气味结合蛋白(Odorant Binding Proteins,OBPs)与化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)用来筛选、结合、运送气味分子。气味受体(Odorant Receptors,ORs)，离子型受体(Ionotropic Receptors,IRs)，感觉神经膜蛋白(Sensory Neuron Membrane Proteins,SNMP)将化学信号转变为神经冲动。气味降解酶(Odorant-Degrading Enzyme,ODE)将刺激受体后的气味分子快速的降解，防止重复性的刺激[3]。ORs和IRs 具有识别与分辨不同气味信号的功能。然而，疏水性的气味分子穿过昆虫亲水性的淋巴液需要两种重要蛋白的结合和运送，才能与受体结合。这2 种蛋白质分别为OBPs和CSPs[4]。由于能够在体外大量、稳定的表达，OBPs 和CSPs 蛋白被广泛研究。尤其是二代测序技术的应用，获得大量基因组和转录组数据使得从分子层面对OBPs 和CSPs 的功能进行阐释。对于这两类蛋白的大多数研究都集中在昆虫嗅觉系统，试图揭示它们在检测和识别外界环境刺激所发挥的功能。然而，越来越多的文章报道在昆虫的非嗅觉器官也发现了此类蛋白，并且行使不同的功能。本研究对CSPs蛋白在昆虫体内具有的不同功能进行了综述，以期为后来的研究者提供理论上的支持。

1 化学感受蛋白的结构

CSPs是紧密的多肽，主要有α-螺旋结构域形成的疏水性的结合口袋[5-6]，此结构与昆虫OBPs 的结构较为相似。1994 年，Mckenna 等在果蝇中首次发现编码CSPs的基因，并被命名为OS-D，起初它们的功能并不被认为与化学感受蛋白有关。直到后来Angeli等在沙漠蝗的触角中发现了一类参与沙漠蝗化学信息素识别的蛋白质，这也是“化学感受蛋白”名字的首次提出[7]。CSPs是一类分子量相对较小的可溶性酸性蛋白质，大小通常在13 ku 左右，由100～115 个氨基酸残基组成[8]。它们在进化上高度保守，不同物种间相似性很高，并且存在明显的高度保守结构域。CSPs 会有4个保守的半胱氨酸保守位点，它们之间会两两配对形成2 个二硫键，以此维持稳定的三级结构。该类蛋白不同物种间的种类多样性主要集中在C-端，有的物种会向外延伸，形成额外的结构域；有的物种C-端会提前终止，序列长度仅仅包含80～100 个氨基酸[2]。这类蛋白已经在松褐天牛(Monochamus alternatus)[9]、甜菜夜蛾(Sopdoptera exigua)[10]、小地老虎(Agrotis ypsilon)[11]、中华蜜蜂(Apis cerana)[12]、西花蓟马(Frankliniella occidentalis)[13]等昆虫中得到克隆。OBPs 基因在触角等感受器官中富集，然而，研究发现CSPs 广泛分布于各个组织，如在体躯、表皮、触角、腹部、下唇须、下颚须、跗节和性腺等部位均有表达[14-16]。并且由于CSPs只有2个半胱氨酸组成的二硫键，它们能够扩大结合口袋来结合较大的蛋白质，比如在鳞翅目害虫棉铃虫(Helicoverpa armigera)的研究中发现，HarmCSP4 与大分子物质β-胡萝卜素有很好的亲和性[17]。这表明CSP 除了具有嗅觉的功能，还在昆虫的生命活动中发挥其他的功能。

2 化学感受蛋白的其他功能

2.1 信息素载体

CSPs 被认为是信息素的载体。研究表明，部分CSPs作为第二类的结合蛋白参与了化学信息的识别：（1）CSPs 在昆虫的嗅觉感受器官中表达丰富，比如在沙漠蝗(Schistocerca gregaria)[18]、金龟子(Coleoptera scarabaeida)[19]。（2）它们能够在微摩尔浓度下结合信息素，这点与OBP极其相似。尤其是蜜蜂的触角特异性蛋白CSP3，能够识别产卵信息素[20]。（3）有研究发现一些昆虫，比如胡蜂(Polistes dominulus)和阿根廷蚂蚁(Linepithema humile)的CSPs 大部分种类主要集中在触角中表达。最近的研究表明，在RNA 水平，触角中有特异性编码CSPs的基因，这表明它们都参与了嗅觉的识别。

以上研究都表明了CSPs参与了昆虫嗅觉的识别，然而和OBPs 不同的是，没有直接的实验证据表明CSPs在昆虫气味识别的过程中发挥的作用。对OBPs的研究大多集中在如何探测性信息素方面。如把一种专一的信息素（性信息素对于果蝇和鳞翅目昆虫，报警信息素对于蚜虫）作为目标，检测特殊蛋白质（受体和OBPs）对于专一信息素的反应。对于CSPs而言，没有广泛存在的专一性信息。因此，单一CSP的存在或缺失，对于气味的识别，不会产生主要的影响。然而，一些OBPs 与几种信息素关联在一起，对于CSPs 而言，有化学物质识别的功能。另外有报道称，日本弓背蚁(Camponotus japonicus)的CSP能够结合表皮的碳水化合物，能够介导同伴的识别的功能[21]。

CSPs 在非嗅觉器官中存在。Jacquin-Joly 对甜菜夜蛾的研究表明，CSPMbraA6 和CSPMbraB1 在甜菜夜蛾的性腺中被鉴定出来。CSPMbraA6 在其触角中被鉴定出来，CSPMbraB1 在喙中被鉴定出来[22]。在甜菜夜蛾的触角和性腺的结合实验表明，放射性标记性信息素都表现良好的结合特性。因此，结构相似甚至是相同的CSPs行使双重的角色，它既能够在嗅觉器官中探测化学信息素，也能够作为载体在分泌器官中释放化学信息素。这类的蛋白质在果蝇的射精管中被鉴定出来，它参与了果蝇性信息素的释放[23]。CSPs在性腺中起着溶解疏水信息素的作用，由性腺分泌并将它们释放到环境中。转录组测序在鳞翅目昆虫的性腺中确认编码CSPs的基因，如斜纹夜蛾(Spodoptera litura)中发现SlitCSP3、SlitCSP14在性腺中高表达[24]，二化螟(Chilo suppressalis)组织表达谱CsupCSP2和CsupCSP10在性腺中高表达，[25]水稻大螟(Sesamia inferens)的转录组测序得到24 个CSP 基因，其中7 个(CSP2、CSP5、CSP6、CSP7、CSP16、CSP20、CSP23)在幼虫和性腺中高表达[26]。

众所周知，蜜蜂拥有复杂的化学语言[27]，这些化学信号调节蜂王与工蜂的行为。一些信息素影响蜂群不同的方面。例如，蜂王的下颚信息素(QMP)能够阻止工蜂产卵，而且通过工蜂调节幼虫的进食，以及在交配飞行时作为性信息素。尽管信息素的释放机制并没有研究的很透彻，但有一点可以表明，释放这些信息的化合物被结合蛋白结合在疏水性的口袋，能够延长它们的活性期并且还能防止被化学酶降解[28]。这也说明腺体中的OBPs 和CSPs 能够根据特定需求调节信息素混合物的成分构成[29]。对昆虫来说，激活特定基因来调节蛋白质的表达更容易也很经济，而不是去合成信息素，因为这常需要另外一些酶的表达与发挥作用。对家蚕触角的蛋白质组进行分析，只发现了预测44种OBPs中的7种；预测的20种CSPs中的4种[30]。然而有7 种CSPs 在雌性性腺中有报道[30]。由于RNA 的可变剪切使得CSPs 出现非常多的变体（仅性腺中CSP1 的变体就有27种），在CSPs中有这么多高数量的变体可能与信息素的生物合成有关[31]。

OBPs 和CSPs 很可能参与了信息素的结合和释放。Ejb-III 是在雄性的果蝇的精液中发现，它与雄性信息素有关。后来，根据蛋白质组学分析，又在果蝇的精液中发现了另外5 种OBPs[32]。在蝗虫的雄性生殖器官中，含有大量的CSP(LmigCSP91)，并能够与性腺中信息素有很好的结合特性。LmigCSP91 仅在雄性的性腺中有发现，在未交配的雌性性腺中没有发现。但是交配后，雌性的生殖器官中也发现了LmigCSP91的存在。这表明，在交配的过程中用LmigCSP91作为性信息素的载体[33]。

2.2 抗药性

近30年来，化学药剂的大量使用的确对害虫的防控和粮食的增产起到了关键的作用。但是其负面的效果也不容小觑，如化学药剂的使用破坏了环境，以及对天敌、非靶标生物和人类造成伤害。此外，害虫对杀虫剂产生抗性也是最严重的问题之一。害虫产生抗药性后，就需要使用更大剂量甚至更多种类的杀虫剂对其进行防治。昆虫产生抗药性的有以下原因：（1）杀虫剂在昆虫体内的靶表基因发生突变；（2）昆虫体内的效应酶降解了杀虫剂分子；（3）害虫抗药性的产生与CSP表达有关。有研究发现，用亚致死浓度的阿维菌素处理家蚕，一些CSP 蛋白会在家蚕的腹部表达显著上调。与此相同，用亚致死浓度的烟碱类杀虫剂噻虫嗪处理白粉虱也得到同样的结果[34]。CSPs在昆虫的腹中可能是一个缓冲的作用，能够包裹有毒的杀虫剂分子，从而随粪便排出体外。在小菜蛾的研究中，用菊酯类农药处理后，小菜蛾发现有3 个CSP 蛋白（CSP4，CSP8 和CSP3）在头部的表达上调[35]。杀虫剂处理后，昆虫化学感受蛋白基因的表达发生变化，这类蛋白的变化与害虫的抗药性如何相互影响，此机制有待进一步的研究。

2.3 视觉色素的载体

Zhu 等[17]在棉铃虫眼中发现了一些CSPs 蛋白，并且有些CSPs 蛋白在昆虫的喙中也有发现。这些CSP可能是作为与昆虫视觉相关的运载体，穿过亲水性的淋巴液。昆虫从食物中获得的类胡萝卜素以及类胡萝卜素的降解产物3-羟基吲哚和3-羟基缬氨酸通过CSPs蛋白进行运输，昆虫正是利用这2种降解产物作为视觉色素的，这不同于脊椎动物的视觉色素——视黄醛、视黄醇。研究证明，也不仅仅只有一种CSP 蛋白作为视觉色素的运载体，Wang等[36]在果蝇中发现了PINTA，包含了长度273 个氨基酸的维生素A 结合蛋白和长度为235 个氨基酸的维生素A 结合蛋白，并且在柑橘凤蝶中也发现了相同的蛋白。这两类蛋白质属于不同的家族，与CSPs完全不相关。这可能和视觉的复杂机制有关，视觉色素的产生、运输和再循环可能需要一些不同功能蛋白的相互作用才可完成。

2.4 营养

昆虫的CSPs蛋白在取食器官中高度表达[37]，并且有研究发现在昆虫取食的过程中发挥重要的功能，如疏水性营养物质的增溶剂和昆虫用喙吸食营养物质时减少压力的表面活性剂。

绿头苍蝇以腐烂的肉和脂肪酸为食，这对它们的繁衍是必不可少的元素。在甘蓝夜蛾的喙中鉴定出几种与探测营养物质相关的CSPs蛋白。另外，一些研究报道称在一些蛾类或蝶类的喙中有高浓度的CSP 分泌。并通过“drink-blot”方法分离出这类的蛋白[38]。如果仅是为了气味探测，不能解释为何喙中有这么高浓度的CSPs 蛋白，尽管化学感受器官在喙的顶端部位。第一种假说是CSPs蛋白作为表面活性剂减少昆虫吸食营养物质时的阻力。然而，从蛾类到蝶类系统发育远缘物种的喙中CSPs蛋白的保守型上来看，除了具有表面活性剂的功能外，这些蛋白还可能具有更多特殊的功能。CSPs蛋白对胡萝卜素的亲和性表明在昆虫取食的过程中它们作为疏水性营养物质的溶解剂和运载体[17]。

2.5 再生和发育

CSPs 蛋白参与昆虫的再生和发育。螳螂在若虫阶段能够再生断掉的腿部，在这个过程中一种10 kDa的蛋白含量极速的上升，在恢复之后又回到原来的生理水平，随后，编码这个蛋白的基因被发现，经测序与发现的其他CSPs基因非常的类似。第二，在蜜蜂的研究中发现，CSP5 对受精卵的发育有至关重要的作用，编码这类蛋白的基因，仅仅在雌性的卵巢和卵上发现，在其他的成虫或幼虫的任何身体部位都没有发现[39]。当用RNAi 技术沉默这个基因的表达后发现，受精卵不能完全发育并且卵也不能孵化[40]。第三，对红火蚁的研究中发现，CSP9参与了红火蚁的发育过程[41]。对红火蚁的CSP9与蜜蜂的CSP5构建系统发育树，它们属于相邻的分支。在红火蚁发育的第3 个阶段，编码CSP9 的mRNA 表达水平达到最高。用RNAi 技术沉默这段基因后，影响了氨基酸的合成和其他新陈代谢途径，使得表皮合成受阻并且影响到了蜕皮作用[41]。

3 结论

综上所述，CSPs 蛋白不仅分布在昆虫的嗅觉器官，也不只与气味分子的的检测和识别有关。CSPs 蛋白还分布在昆虫的其他器官，并具有不同的生理功能，比如与昆虫的发育和抗药性相关。CSPs 蛋白参与昆虫体内许多不同的生理活动，使研究者能够有一个合理的推断：与它们不同功能相关的统一特征是CSPs 蛋白具有稳定和紧凑的结构，可以结合和溶解疏水性小分子。这些疏水性的小分子可能是性腺分泌的性信息素、乳脂类的营养物质、视觉相关的色素、能够与杀虫剂分子结合从而增加昆虫的抗药性或者运输与昆虫的发育相关的激素。因此，研究CSPs 蛋白参与害虫抗药性的发生过程，对于减缓害虫抗药性的产生是一个新的切入点。并且，由于CSPs蛋白保守的结合位点和多变的结构特征，利用分子对接技术筛选与CSPs蛋白高亲和性的气味分子，可以解决单一性信息素分子引诱效率低的问题