番茄早疫病病原菌分离纯化及分子鉴定

赵世明 律凤霞

摘 要：分离纯化番茄早疫病致病真菌并提供病原纯菌株.从牡丹江市郊区棚室栽培地采集疑似感染早疫病的番茄叶片进行内源病菌分离培养和生物学初筛纯化和测序，8株菌有黑色素分泌且镜检到分生孢子，其中3株PCR产物序列相同，与网站公布的链格孢菌高度同源，确定获得番茄早疫病病原纯菌株.

关键词：番茄早疫病;病原菌;分离纯化;分子鉴定

[中图分类号]   [文献标志码]A

Abstract：In order to isolate and purify the pathogenic fungi of tomato early blight，to provide pure strains of the pathogen，pure strains of the pathogen were obtained from tomato leaves suspected to be infected with early blight from different greenhouse cultivation sites in the suburbs of Mudanjiang.The results showed that 8 strains had melanin secretion and Conidia were detected by microscope，3 of them had the same PCR product sequence and high homology with Alternaria tenuissima published on the website，identified as obtain the pure pathogen of tomato early blight.

Key words：tomato early blight;pathogen;isolation and purification;molecular identification

番茄，茄科番茄属，一年生或多年生草本植物，其果实营养丰富，风味独特，可生食，也可加工食用，是三大世界性贸易蔬菜之一.我国番茄产业发展迅速，番茄生产位居全球第一，是我国经济收入较高的重要蔬菜品种之一.[1-2]番茄栽培除露地栽培外，更多的是棚室栽培.番茄病害发生是影响栽培产量和产品品质的主要原因.番茄早疫病（Tomato Early Blight）就是番茄栽培中重要病害之一.番茄早疫病又称为“轮纹病”，该病菌寄主范围广泛，发病时主要危害叶片、茎和果实.[3]病原菌以分生孢子或菌丝体随病残体遗落土中越冬，春天番茄种植后以分生孢子借气流传播蔓延、初侵染和再侵染，属多循环病害.结果盛期发病严重，重茬地、瘠薄地或通风不良栽培地发病较重，农民经济损失严重.[4-5]植物病原菌的分离纯化不仅是植物病害诊断的主要依据，也是栽培过程中综合防治及抗性育种的病原基础.[6]笔者分离纯化了牡丹江市郊区农田的番茄早疫病致病真菌，经微生物形态学和分子生物学验证，确认其是引起病害的病原菌种属，为番茄栽培中病害诊断防控及抗病育种提供病原纯菌株.

1 材料与仪器

试验材料 牡丹江市郊区农田番茄栽培地采集的早疫病症状的番茄叶片.

试验仪器 PCR试剂盒（宝生物工程有限公司产品），真菌DNA提取试剂盒（QIAGEN公司产品），琼脂糖（Sigma 公司产品）.

2 试验方法

病原物初培养后转板纯化 超净工作台内选择带有明显病害症状、病健交界清晰的番茄病叶，1.5‰升汞浸泡7 min，无菌水多次清洗，无菌剪刀剪取病健交界组织约1 cm2，平摆至PDA培養皿中.封口膜封边，25 ℃恒温倒置暗培养，每个调查点做一个平板.当病组织边缘有内寄生菌生长时，无菌环境下挑取菌落外缘菌丝，两点接种转板至新PDA培养基，多次转板直至菌落单一，达到纯化目的.

纯化的单菌落色素分泌及分生孢子辨析 纯培养早疫病菌的菌丝初期灰白色，后期有黑色素分泌.以黑色素分泌为条件，初筛培养物，继续培养至菌落呈全黑色.无菌解剖刀刮挑菌落表面物，制玻片，显微镜下观察病菌形成的分生孢子器和散落的分生孢子形态.[7]

单菌落病菌的DNA分子鉴定 呈全黑色的初培养菌落继续培养至有较厚菌膜形成，刮取菌膜经液氮速冻后试剂盒提取菌丝DNA[8-10]，以真菌ITS通识引物（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITs4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行PCR扩增，反应体系见表1.PCR产物经1%琼脂糖电泳，有大于500 bp特异带的PCR产物送去测序，测序结果在NCBI网站BLAST比对.[11-13]

纯化病原菌的保存 经NCBI网站BLAST比对验证病原菌纯培养物，转接至试管PDA培养基培养，菌丝长满试管，放4 ℃冰箱暂时保存.

3 结果与分析

3.1 田间番茄病叶早疫病症状初鉴别

高温高湿是早疫病发生的主要环境因子之一，因此，前期采集病样选择棚室番茄栽培地调查，患病番茄叶片初期为散布的褐色小斑点，逐

渐扩展为同心轮纹褐斑.病斑区域略凹陷，病斑边缘有黄绿色晕环，湿度大时病斑连片且表面有明显的黑粉物.见图1.

3.2 病原菌分离纯化及生物学特性初筛鉴定

升汞表面消毒后的病叶组织接种到PDA培养基上，每24 h观察一次内源病菌的萌发情况，剔除有杂菌污染的培养皿，见图2.一周左右病叶边缘有明显菌丝萌发，病原菌萌发初期菌丝为浅白色，菌落中心灰黑色.

3.3 纯培养物色素分泌及分生孢子形态分辩

为了更好的辨识病原菌的微生物形态，需要培养病菌的单菌落.当病叶边缘有明显菌落形成时，分别对应转接到新的PDA培养基中，继续恒温暗培养.多次转板至形成纯单菌落，见图3.转板初期菌丝白色，病菌继续生长菌落直径增加，菌落中心灰黑色至纯黑色.培养2周后，菌落长满培养皿呈全黑色，见图3、图4，符合早疫病菌黑色素分泌的微生物学特征.