参草通脉颗粒对慢性心力衰竭大鼠抗心室重构机制的影响

刘晓蕾 张艳 礼海 王懿 周雪 陈菲

[摘要] 目的 分析參草通脉颗粒对慢性心力衰竭（CHF）大鼠抗心室重构的作用机制。 方法 选取SPF级大鼠60只，随机抽取10只大鼠作为正常组，其余50只大鼠制备CHF大鼠模型，造模死亡9只，将剩余41只，随机分为模型组13只、参草通脉颗粒组14只、赖诺普利组14只。正常组和模型组大鼠不用药，赖诺普利组和参草通脉颗粒组大鼠连续给药42 d。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（WB）法测定基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）的mRNA和蛋白表达。 结果 与模型组比较，参草通脉颗粒组和赖诺普利组MMP-1 mRNA和蛋白均降低，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）;与赖诺普利组比较，参草通脉颗粒组MMP-1 mRNA表达降低（P < 0.05），而MMP-1蛋白表达升高（P < 0.05）。与模型组比较，参草通脉颗粒组和赖诺普利组TIMP-1 mRNA和蛋白均增加，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）;与赖诺普利组比较，参草通脉颗粒组TIMP-1 mRNA和蛋白表达增加（P < 0.05）。 结论 参草通脉颗粒治疗CHF大鼠效果显著，具有抗心室重构的作用。

[关键词] 慢性心力衰竭;参草通脉颗粒;基质金属蛋白酶-1;金属蛋白酶组织抑制物-1

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（c）-0008-04

Effects of Shencao Tongmai Granules on the mechanism of anti-ventricular remodeling in rats with chronic heart failure

LIU Xiaolei1   ZHANG Yan2   LI Hai1   WANG Yi1   ZHOU Xue1   CHEN Fei1

1.Department of Medical， Shenyang Second Hospital of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang   110015， China; 2.Expert Consultation， Affiliated Hospital， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Liaoning Province， Shenyang   110015， China

[Abstract] Objective To analyze the mechanism of Shencao Tongmai Granules on anti-ventricular remodeling in rats with chronic heart failure （CHF）. Methods A total of 60 SPF rats were selected and ten rats were randomly taken as normal group. The other 50 rats were used to prepare the CHF rat model. In the process of modeling， nine rats failed to survive and the remaining 41 rats were divided into the model group （13 rats）， the Shencao Tongmai Granules group （14 rats） and the Lisinopril group （14 rats） randomly. Rats in normal group and the model group were fed normally without drugs and rats in Lisinopril group  and Shencao Tongmai Granules group were given drugs consecutively for 42 d. Reverse transcription PCR （RT-PCR） and Western blot （WB） were adopted to determine the mRNA and protein expression of matrix metalloproteinase-1 （MMP-1） and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 （TIMP-1）. Results Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of MMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group and Lisinopril group were reduced， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the Lisinopril group， the MMP-1 mRNA expression of the Shencao Tongmai Granules group was decreased （P < 0.05）， while MMP-1 protein expression was increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the mRNA and protein expressions of TIMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group and Lisinopril group both increased， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. Compared with the Lisinopril group， the mRNA and protein expressions of TIMP-1 in the Shencao Tongmai Granules group were increased （P < 0.05）. Conclusion Shencao Tongmai Granules have a significant therapeutic effect on treating rats with CHF and can promote the mechanism of anti-ventricular remodeling.

[Key words] Chronic Heart Failure; Shencao Tongmai Granules; Matrix metalloproteinase-1; Tissue inhibitor of metalloproteinase-1

慢性心力衰竭（CHF）是以舒缩功能障碍为主的严重的临床综合征[1]。长期应用常规西药治疗可出现诸多不良反应[2]。参草通脉颗粒是临床应用30余年治疗CHF的经验方，通过多年的临床观察和试验，参草通脉颗粒对CHF患者疗效确切[3]。本实验从基因和蛋白表达两方面，分析参草通脉颗粒对CHF的疗效机制和作用靶点，为临床治疗CHF提供可靠依据，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取体重为300～350 g，15周龄，SPF级SD雄性大鼠60只[由辽宁中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2015-0001，合格证号：201703120]，本研究经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物制备

赖诺普利片（规格：10 mg/片，批号：H20131015），由上海信谊万象药业生产。参草通脉颗粒组成：丹参、人参、黄芪、红花、三七粉、益母草、茯苓、葶苈子（由本溪三药有限公司生产，批号：辽药制Z0901013），处方中的全部药材均符合参照《中国药典》[4]2010版有关规定。

1.3 实验试剂和仪器

基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、金属蛋白酶组织抑制物-1（TIMP-1）聚合酶链式反应（PCR）试剂盒（XG-E1088，大连TaKaRa公司）;实时荧光定量PCR仪（A-2060-1，Bioneer公司）;PCR扩增仪（96G，Biometra公司）;全自动蛋白印迹（WB）分析仪（SW1022-ProfiBlot 48型，Bioneer公司）。

1.4 CHF大鼠动物模型制备

大鼠正常条件下适应喂养7 d后，为全部动物编号后随机抽取10只大鼠作为正常组，大鼠正常饲养。其余大鼠禁食不禁水12 h后，麻醉，气管插管，连接呼吸机，消毒后在左侧第3、4肋间横向切开长1～2 cm，用缝合线结扎距离左冠脉前降支起始点2～3 mm处，心电图提示胸导ST段和T波出现明显异常，将心脏送回胸腔，用注射用青霉素钠（哈药集团制药总厂，批号：H23021439，规格：800 000 U/支）在手术切口处敷用，大鼠生命体征平稳后，撤掉呼吸机。术后连续3 d应用注射青霉素钠300 000 IU，1次/d。正常饲养1周后，喂养饲料减少1/2;同时大鼠每天进行1次力竭式游泳，连续4周。当大鼠出现毛色无光泽、精神萎靡、一般状态较差，经超声检测左室射血分数（LVEF）≤60%，判定为大鼠CHF造模成功[5]。

1.5 实验分组与给药

大鼠造模死亡9只，将剩余41只大鼠，按照体重大小依次排序编号，采用随机数字表求余数法将其分为3组，分别是模型组13只、参草通脉颗粒组14只、赖诺普利组14只。正常组10只为正常喂养未手术造模的大鼠。正常组和模型组大鼠不用药，灌胃生理盐水10 mL/kg，1次/d。其余组大鼠用药剂量，按人鼠剂量换算公式，药品剂量（g/kg）=人口服剂量（g）×0.018/动物体重（kg）[6]，计算出赖诺普利组：1.5 mg生药/（kg·d），参草通脉颗粒组：9.2 g生藥/（kg·d），两组药溶于3 mL蒸馏水中，进行灌胃1次/d，各组连续给药42 d。

1.6 实验取材

大鼠麻醉、处死，取其心肌组织，每只大鼠心肌组织按照标准处理分成两份，每份100 mg，放入液氮 -80℃条件下保存，用于逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和WB技术检测MMP-1和TIMP-1含量。

1.7 RT-PCR试验

①TRIzol法抽提总RNA;②测定RNA浓度和纯度;③逆转录合成cDNA;④进行PCR扩增;⑤PCR扩增应用ABI 7500扩增仪，PCR反应条件为预变性95℃，0.5 min，1个循环;变性95℃，0.05 s，退火60℃，34 s，延伸95℃，0.15 s，共40个循环，终延伸60℃，1 min;⑥利用Prime 5.0软件设计引物序列、扩增产物长度。引物序列一览表见表1。

1.8 WB试验

取出心肌组织100 mg，块剪碎后，以12 000 r/min，离心半径为8 cm下，离心5 min，吸取上清提取蛋白;测定蛋白浓度;蛋白变性;灌制浓缩胶和分离胶;电泳;转印120 min，TTBS洗膜1次，封闭;一抗孵育：加入1∶400的一抗，置于20～25℃，2 h;二抗孵育：加入碱性磷酸酶标记的1∶2000二抗，20～25℃，2 h;清洗;显色;采用FlourChem V 2.0凝胶成像分析软件（America）分析，记录每条蛋白电泳带的灰度值，分析定量。

1.9 统计学方法

应用SPSS 22.0对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，多组间样本比较应用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学分析，组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织MMP-1 mRNA和蛋白的表达

与正常组比较，模型组MMP-1 mRNA和蛋白表达升高（P < 0.01）;与模型组比较，参草通脉颗粒组和赖诺普利组MMP-1 mRNA和蛋白均降低（P < 0.01）;与赖诺普利组比较，参草通脉颗粒组MMP-1 mRNA表达量降低（P < 0.05），而MMP-1蛋白表达升高（P < 0.05）。见表2。

2.2 各组大鼠心肌组织TIMP-1 mRNA和蛋白的表达

與正常组比较，模型组TIMP-1mRNA和蛋白表达下降（P < 0.01）;与模型组比较，参草通脉颗粒组和赖诺普利组TIMP-1 mRNA和蛋白均增加（P < 0.01）;与赖诺普利组比较，参草通脉颗粒组TIMP-1 mRNA和蛋白表达增加（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

CHF发生的基本机制是心室重构，而细胞外基质（ECM）的结构和成分的改变、合成和降解的失衡，是导致心室重构的重要原因[7]。基质金属蛋白酶（MMPs）对ECM有很高亲和力，能特异地降解ECM[8]。金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs）可以抑制MMPs的活性，在正常心肌组织中，MMPs与TIMPs保持着动态平衡，共同维持着ECM合成与降解的平衡[9]。在衰竭的心肌组织中，MMPs活性升高导致纤维胶原降解、ECM重构[10]。MMP-1是MMPs的一种，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原[11]。TIMP-1与MMP-1有高度亲和力，研究发现敲除TIMP-1的小鼠，心肌胶原含量下降，左室几何形状发生改变[12]。MMP-1与TIMP-1在正常组织中保持动态平衡，共同协调ECM的合成与降解，维持心肌组织结构的完整性[13]。心衰的心脏中，MMP-1活性持续增高，TIMP活性降低，致使ECM合成与降解比例失调，心肌胶原纤维代谢紊乱，最终导致心室重构的发生[14]。因此调节心肌MMP1与TIMP-1的表达和活性，成为控制心衰进展中心脏基质的组织修复和再生的重要治疗手段[15]。

参草通脉颗粒是多年临床治疗CHF的经验方，试验结果证明参草通脉颗粒可明显改善患者心功能分级，提高LVEF[3]。药理学研究表明[16]，黄芪可改善心肌舒缩功能、抑制纤维化。人参可降低心肌胶原含量，减少心肌纤维化程度，延缓心室重构[17-18]。红花具有兴奋心脏的作用，能增加冠状动脉血流量、改善心肌缺血[19]。丹参可抑制Ca2+内流，阻止心肌肥厚信号传导[20]。益母草对心肌肥厚具有一定的抑制作用[21]。三七可提高Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性、改善离子转运、抑制心肌胶原增生[22]。葶苈子和茯苓均具利尿消肿的作用[23-24]。

本研究结果显示，与模型组比较，参草通脉颗粒组和赖诺普利组MMP-1的基因和蛋白表达均降低，TIMP-1的mRNA和蛋白表达升高。与赖诺普利组比较，参草通脉颗粒组MMP-1的mRNA表达下降和TIMP-1 mRNA和蛋白表达升高，MMP-1蛋白表达升高。

综上所述，参草通脉颗粒能够抑制MMP-1表达，上调TIMP-1表达，增强TIMP-1对MMP-1的抑制作用，调节ECM合成与降解比例，维持心肌胶原蛋白的形态和结构，阻止室壁变薄和心室扩张，具有抗心室重构的作用。

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（收稿日期：2020-04-16）

[基金项目] 国家自然科学基金资助项目（81774157）。

[作者简介] 刘晓蕾（1983.6-），女，硕士;研究方向：中医药防治心脑血管疾病。

[通讯作者] 张艳（1960.10-），女，博士，主任医师，博士生导师;研究方向：中医药防治心脑血管疾病。