铂纳米修饰电极对芦丁的测定

金 晶

（湖北恩施学院医学院,湖北恩施445000）

0 引言

芦丁作为一种黄酮类化合物广泛的存在于天然产物芸香科和石楠科植物中[1]，是一味天然药物且含量丰富，芦丁对很多疾病有很好的治疗及缓解作用，如糖尿病、心脑血管疾病、痛风、肥胖、高血压等[2-4]，目前已经被广泛的应用于对疾病的治疗及病痛缓解。如：珍菊降压片作为一种常见的降压药，在临床上其降压效果平稳，见效快，几乎无副作用产生，该药一直受到很多高血压患者的青睐是常用的降压药，芦丁作为其中的一种主要成分，其药理作用主要是改变人体内毛细血管的通透性和张力的大小，和其他四种成分野菊花膏粉、珍珠层粉、盐酸可乐定、氢氯噻嗪共同协同作用达到降压的目的。故芦丁的含量的测定对药片的制备具有非常重要的意义。目前芦丁的测定方法有很多，其中电化学方法对芦丁测定有荧光探针猝灭法[5]、方波伏安法（SWV）[6]、循环伏安法（CV）[7]、差分脉冲伏安法（DPV）[8]、液相色谱法-电化学发光等[9]，这是由于电化学方法具有灵敏，快速，成本低的特点。基于此实验采用CV和DPV连用的方法，在活化玻碳电极（AGCE）上电沉积纳米铂粒子（PtNPs），PtNPs具备优良的传导电子的能力是一种优良的导电材料，与AGCE结合后使得电极的导电能力进一步增加，构建的电极对芦丁有很好的电化学响应，并成功的用于测定珍菊降压片中芦丁的含量。

1 实验部分

1.1 仪器

JSM-7800F扫描电子显微镜（日本JEOL公司），CHI660E电化学工作站(上海CHI公司)；三电极体系：工作电极为玻碳电极，参比电极为Hg/Hg2Cl2(饱和KCl)，并以铂丝电极作为对电极；KQ218超声波洗器（昆山市超声仪器有限公司）

1.2 试剂

H2PtCl6·6H2O(99.9 wt%)购于Alfa Aesar（美国）。浓硫酸购武汉市中天化工有限责任公司（中国武汉）。芦丁标准品、磷酸、硼酸、乙酸、氢氧化钠均从国药集团化学试剂有限公司（中国上海）购买。不同pH的B-R缓冲溶液（用由0.04 mol/L的磷酸、硼酸、乙酸和0.2 mol/L氢氧化钠溶液混合配置而成）。珍菊降压片 （产品编号：14002081692）购于恩施州中心医院，二次蒸馏水，所用试剂都是分析纯试剂。

1.3 电极的制备

将玻碳电极（GCE）依次用0.3、0.1、0.05μm的Al2O3打磨光亮，然后分别用二次蒸馏水、丙酮、乙醇超声清洗5 min，冲洗后室温下晾干。取4支上述电极，分别采用四种活化方式[10-11]对电极进行处理。四种活化方式参数如下（1）酸法循环伏安法：0.5 mol/L H2SO4溶液中，电位窗口为-0.5～1.6 V之间，以0.1 V/s的扫速至电化学响应曲线稳定；（2）酸法恒电位法：0.5 mol/L H2SO4溶液中，电极分别在2.0 V、-1.0 V恒电位条件下极化1 min；（3）碱法循环伏安法：在0.5 mol/L NaOH溶液中，电位窗口-0.5～1.2 V之间，以0.1 V/s的扫速至电化学响应曲线稳定（4）碱法恒电位法：0.5 mol/L NaOH溶液中分别在1.5 V、-0.5 V恒电位条件下极化1 min。将电极活化后然后采用循环伏安法在-0.5～0.8 V以0.1 V/s的扫速至电化学响应曲线稳定，并分别对10μmol/L芦丁进行检测得到的电化学响应曲线进行比较选取最佳活化方式。以最佳活化方式活化的电极得到AGCE，置于H2PtCl6（1%）溶液中在-0.2 V的条件下恒电位沉积纳米铂，形成Pt NPs/AGCE电极。电极形成过程图如图1所示。

图1 电极的形成过程Fig.1 the formation process of the electrode

2 结果与讨论

2.1 铂纳米颗粒的扫描电镜表征

从图2可以清晰的看到粒径为10～20 nm之间的铂纳米粒子，均匀的附着在玻碳电极表面，证明PtNPs/AGCE电极的成功构建。

图2 PtNPs/AGCE的扫描电镜图Fig.2 SEM image of PtNPs/AGCE

2.2 不同活化方式的比较

图3为四种不同的活化方式活化的电极对芦丁的CV电化学响应图，各电极对芦丁测定的CV响应曲线是以pH=3的B-R缓冲溶液为支持电解质，在扫描区间为0.2～0.8 V，扫速为0.1 V/s的条件下得到的，与文献所报道的相一致[10]，由图可以看出两种酸法活化法的峰电流比两种碱法活化法的峰电流都要大，但背景峰电流却非常大，且对于酸法活化不能保证每次的背景峰电流的稳定性，这对芦丁的含量有很大的影响，综合考虑选择稳定较好背景峰小的碱法恒电位法做为活化电极的最佳方法。

图3 四种不同活化方式的比较:(a)酸法循环伏安法;(b)酸法恒电位法;(c)碱法恒电位法;(d)碱法循环伏安法Fig.3 The comparison of four different activation methods:(a)Cyclic voltammetry acid method;(b)Potentiostatic acid method;(c)Cyclic voltammetry alkaline method(d)Potentiostatic alkaline method

2.3 芦丁在不同电极下的CV响应

实验对比了GCE（a）、AGCE（b）和PtNPs/AGCE（c）这三种不同电极对芦丁的电化学响应信号（图4），发现随着电极的不断形成，芦丁在电极表面的氧化还原峰电流不断增强，峰电位也不断缩小，芦丁在PtNPs/AGCE上氧化峰电流与还原峰电流之比为1.32，峰电位为27 mV，与标准氧化还原峰电位59/n（其中n为转移电子数）相比，表现出准可逆的氧化还原反应且转移电子数为2。

图4 芦丁在不同电极下的响应(a)GCE(b)AGCE(c)PtNPs/AGCEFig.4 curent response of Rutin under different electrode(a)GCE(b)AGCE(c)PtNPs/AGCE

2.4 条件优化

为了使构建的电极对芦丁的测定达到最佳的状态，实验对扫速、pH镀铂量进行了考察，当扫描速度从0.02～0.1 V/s逐渐增加时，芦丁在电极上的氧化还原峰电流的不断增加（图5 A），还原峰电流分别与扫速成良好的线性关系，线性方程为 IμA=(21.65±1.07)v(V/s)+(0.17±0.06)， R2=0.9886这说明了芦丁在检测体系中表现为吸附控制，实验选取了0.1 V/s作为最佳扫速。

图5 条件优化(A)扫描速度(B)pH(C)镀铂的时间Fig.5 conditions optimization(A)scanning speed(B)pH(C)platinum plating time

图5B为PtNPs/AGCE在不同pH下芦丁DPV电化学响应曲线，图中可以看出随着pH值的的不断增加，电流值不断减小，峰电位发生了明显的偏移，且峰电位与pH值的大小呈线性关系，Epa=-(0.05623±0.0027)pH+(0.6787±0.0132)，R2=0.9911，与能斯特方程的斜率做比较-0.059 m/n（其中m为参与反应的质子数，n为反应电子转移数）做比较，则可以推断出芦丁在氧化反应过程中是等质子等电子参与的反应，pH=3的BR缓冲溶液中芦丁表现出最强的峰电流故选其作为支持电解质。

纳米铂的量直接会影响电极的导电性，故实验对镀铂量进行了考察，图5C中可以看出随着镀铂时间的不断增加DPV峰电流不断增强当时间到达120 s时峰电流达到最大，随后逐渐下降，这是由于镀的纳米铂太厚阻碍了电子的传递，故选取120 s作为最佳镀铂时间。

2.5 对芦丁标准溶液进行测定

在最优化的条件下，采用DPV方法在电位区间0.2～0.8 V内，对不同浓度的芦丁标准品溶液平行测定三次，得到的结果如图6所示，当芦丁标准溶液的浓度在0.05～16μmol/mL时随浓度的不断增大，峰电流与浓度呈良好的线性关系，得到的线性方程为IμA=-(0.4160±0.0163)cμmol/L-(2.8673±0.1319)(R2=0.9909)，并有一个较低的检测限为0.006μmol/L(S/N=3)。

图6 对不同浓度的芦丁标准溶液的检测及线性关系，芦丁标准溶液浓度分别为:0.1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、15μmol/LFig.6 detection of different concentrations rutin standard solution and the linear relationship,concentration of rutin respectively:0.1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、8μmol/L、10μmol/L、12μmol/L、15μmol/L

2.6 电极的选择性、稳定性、重复性和精密度

为了考察电极在对芦丁检测时的抗干扰能力，实验引入了的抗坏血酸、L-半胱氨酸、葡萄糖及常见的离子Zn2+、Ca2+、K+、SO42-、Cl-浓度均为100μmol/L作为干扰物，当检测体系分别只含有上述分子或离子时，DPV峰电流几乎没有响应，分别加入10μmol/L芦丁后的电流值与只含10 μmol/L芦丁的峰电流比较，峰电流值的变化小于5%，则证明PtNPs/AGCE对芦丁是有很好的选择性。实验用一只电极考察了电极测定芦丁的稳定性，分别考察了12 h、24 h、48 h、72 h、96 h电极的稳定性发现电极在72 h内具有良好的稳定性，且RSD=1.86%。随后制备6支电极考察了电极制备过程的重复性，并对10μmol/L芦丁进行测定，测定结果之间的RSD=3.43%，说明电极制备方法是可以重复的。用一支电极对芦丁溶液进行平行6次测定以对电极的精密度考察，峰电流之间的RSD=2.57%，证明电极具有良好的精密度。

2.7 对珍菊降压片中芦丁的测定

取珍菊降压片20片称量其总重并计算出平均片重，然后用研钵将药片研细，并称取四分之一倍平均片重粉末的量（每片含芦丁20 mg）置于100 mL的容量瓶中，加50 mL pH=3的B-R缓冲溶液超声溶解30 min后定容，摇匀，过滤，取10 mL滤液于100 mL的容量瓶中用缓冲溶液稀释定容至刻度，摇匀，同时制备三份待测样品溶液。将制备好的电极对样品溶液进行测定，得到结果的平均值为7.91±0.26μmol/L，与理论值8.19 μmol/L相比较相差3.4%，证明AuNPs/AGCE可以用于对珍菊降压片制备过程中芦丁含量的检测。

2.8 加样回收实验

将上述制备的样品溶液稀释为原浓度的一半分成四份，分别加入芦丁标准品使得四份样品溶液中分别含有0，2，4，6μmol/L的芦丁标准品，将配好的溶液进行检测得到如表1所示的结果，电极表现出良好的回收率在96.5%～103.3%之间，RSD范围在2.54%～4.31%，说明该方法具有良好的准确度，进一步证明了该电极不仅可以用于对珍菊降压片中芦丁的检测。

表1 珍菊降压片中芦丁的测定结果Tab.1 Measurement results of rutin in Zhenjujiangya Tablet

3 结论

实验利用PtNPs与AGCE电极两者的协同作用构建了一种简单灵敏的测定芦丁的方法，对芦丁标准品检测有一个较宽的线性范围和一个较低的检测限，经验证该电极具备良好的稳定性，重复性和精密度，在对珍菊降压片中芦丁含量的测定时，测定值与理论值只相差3.4%。该方法简单，且对芦丁测定稳定，可以推广到对其他药片中芦丁含量的测定。