DMH1联合Forskolin诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化的诱导效果分析

顾 文，杨建东

（1.扬州大学医学院，江苏 扬州 225000；2.江苏省苏北人民医院，江苏 扬州 225000）

DMH1为一种小分子化合物，常用于骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）的抑制剂中。近几年的文献报道，小分子化合物DMH1可促使hiPSCs产生神经元细胞[1]。Forskolin在许多细胞类型中，是一种有效的腺苷酸环化酶激活剂，相关文献报道，脂肪源性干细胞不仅有自我唤醒的能力，而且还具有万能性，与其它干细胞一样，是通过bFGF结合Forskolin诱导产生神经细胞[2]。本文旨在叙述DMH1联合Forskolin诱导骨髓间充质干细胞的形态变化及NSE、Nestin、SOX1的表达水平分析，给神经系统疾病的治疗措施提供新的研究方向。

1 资料与方法

1.1 实验动物

采购（一月龄）SPF级SD大鼠2只作为研究对象，每只体重为（101±13）g。

1.2 实验试剂

实验试剂采用DMEM/F12培养基，胎牛血清，胰酶，盘尼西林，链黴素A，DMH1，Forskolin，蛋白提炼试剂盒，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术试剂盒，牛血清白蛋白（BSA），抗NSE、Nestin、SOX1及β-actin抗体，单克隆抗体（CD34、CD44、CD45、CD90、CD105）。

1.3 实验方法

1.3.1 骨髓间质干细胞培养

使用颈椎脱臼法快速将SD大鼠杀死，然后进行酒精彻底消毒，在净化工作台上实施剖解，解剖时将大腿骨与胫骨分开，使用注射器吸取DMEM/F12培养基液（含10%FBS）清洗大腿骨与胫骨的骨髓腔，然后收集培养基液来回吹打成细胞悬液。对悬液进行细胞密度测定，再次使用培养基液稀释细胞，细胞密度调成1×109/L后倒入培养皿里将其铺匀。然后使用胞培养箱进行贴壁培植细胞，温度为37℃，CO2浓度为5%。等细胞贴壁滋长后，2 d更换50%新鲜培养基，3 d将其全部更换，然后用显微镜查看细胞状态，若细胞滋长平稳，间隔2d更换所有新鲜培养基液，如果贴壁滋长的细胞汇合度为80%-90%时，能够将细胞进行传代，其比列为1:2。

1.2.2 骨髓间质干细胞鉴定

采集生长形态很好的P3代细胞，用0.25%胰酶消化细胞，离心4℃，转速1000 r/min离心5 min，使用磷酸缓冲盐溶液（含1%BSA）冲洗细胞3次，计算细胞数，将单克隆抗体CD34、CD44、CD45、CD90、CD105按顺序加入各细胞管。并且将每个细胞管都设置一个阴性作为参照对象。然后放于避光冰上孵育，时间为45 min，再次用磷酸缓冲液冲洗细胞3次，为清除细胞上没有结合的抗体，最后用500 μL磷酸缓冲液重新悬浮细胞，采用流式细胞仪进行骨髓间质干细胞鉴定。

1.3.3 DMH1与Forskolin诱导骨髓间充质干细胞分化

使用第3代形态良好的细胞，将密度调成5×105个/mL在培养皿铺匀培养，其汇合度达到70～80%时，开始用Forskolin（0.01 mm）预诱导，时间为1 d，进而用DMH1（0.04 mm）诱导，时间为3d，并采用不诱导细胞为参照对象。最后查看细胞状态情况。

1.3.4 Western Bolt检测骨髓间充质干细胞特异性蛋白水平

采集培养过的细胞将其裂解后提炼蛋白质，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶实施蛋白质电泳，后转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用BSA封闭，进而将一抗NSE、β-actin、SOX1及Nestin抗体搀和，4度孵育一夜，最后进行二抗室内温度孵育2h显色后照相。

1.3.5 RT-PCR分析

采取3×106cells/mL未诱导及诱导的骨髓间充质干细胞，通过TRIZOL法抽提核糖核酸（RNA）。以试剂盒说明进行RT—PCR分析。共30个循环，采用浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察凝胶成像系统并拍照。

2 结 果

2.1 诱导前后的细胞状态观察

诱导前，使用显微镜观察细胞，细胞状态分开并贴壁滋长，参差不齐，形态各异，滋长状态优异。DMH1联合Forskolin诱导第1d，细胞折射产生变化，并发现部分细胞突起。诱导第3d，细胞折射性显著高于诱导第1天，其状态显著变化，并且细胞长突起，构成网状。

2.2 Western Bolt 检测特异性蛋白水平

诱导后，检测诱导细胞的NSE、Nestin、SOX1及内参β-actin蛋白的表达情况，结果显示，NSE、Nestin及SOX1蛋白的表达水平提高。

2.3 RT—PCR检测骨髓间充质干细胞中的蛋白基因表达水平

采用RT—PCR检测诱导与未诱导骨髓间充质干细胞中的蛋白基因表达水平情况，结果发现，NSE、Nestin、SOX1及内参β-actin蛋白在骨髓间充质干细胞中均有表达，而且NSE、Nestin、SOX1的表达水平明显上升。

3 讨 论

化学生物学是一门交叉学科，是通过活跃的小分子化合物干扰蛋白质与分解生物，可识别生物特点与内在规律[3]。小分子化合物可迅速诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化，能够准确把握诱导时间，而且将小分子的浓度调整，作用效果可反向进行。小分子化合物混合后具有稳定性、有效性和极易量化，可重复，而且成本较低，对培养细胞来说至关重要。随进一步的研究显示，小分子化合物在干细胞诱导中具有至关重要的作用[4]。相关研究显示，有学者采用小分子化合物诱导骨髓间充质干细胞的万能性，如使用β-巯基乙醇、二甲亚砜及丁基大茴香醚等小分子化合物成功诱导细胞向神经元分化[5]。而且用丙戊酸钠（VPA）、CHIR99021、Repsox 化学鸡尾酒联合诱导后，向小鼠与人的神经元分化。

本研究采用DMH1联合Forskolin诱导骨髓间充质干细胞后，转变成神经元细胞。开始使用Forskolin预诱导细胞，是因该小分子化合物为一种腺苷酸环化酶激活剂，能够调控细胞转变成神经元，而且Forskolin可进一步使神经细胞轴突生长。进而用DMH1诱导，是因DMH1为一种BMP的有效抑制剂，可阻碍BMP的路线，骨髓间充质干细胞就不会往中胚层分化，所以，可帮助细胞产生神经元。本研究结果表明，诱导后，细胞折射性显著增强，其状态显著变化，并细胞长突起，构成网状。诱导后，通过Western Bolt 检测结果显示，特异性NSE、Nestin及SOX1蛋白的表达水平提高。并且RT—PCR检测骨髓间充质干细胞中的蛋白基因表达水平显示，内参β-actin蛋白的表达水平无明显变化，而NSE、Nestin、SOX1的表达水平明显上升。

综上所述，采用DMH1联合Forskolin诱导骨髓间充质干细胞后，产生神经元细胞。由于DMH1、Forskolin的小分子化合物还不明确，诱导时存在一定的安全隐患，仍需改进DMH1、Forskolin联合协作诱导的方法，如果深入探究或许对再生医学迅速进展有帮助。