B/C基因型的乙型肝炎病毒对不同免疫阶段慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞及其亚群的影响

高 鹏，雒艳萍，李俊峰

(1.兰州大学第一医院传染病研究室，兰州 730000； 2.兰州大学基础医学院免疫教研室，兰州 730000)

乙型肝炎的发生发展与机体病理性免疫损伤、特别是与以T淋巴细胞及其亚群介导的细胞免疫应答密切相关。乙型肝炎病毒在我国以B基因型和C基因型为主，B/C基因型的乙型肝炎病毒的发病机制有很大差别，但是目前很少有文献探讨在不同免疫阶段B/C基因型乙型肝炎病毒感染的人体中T淋巴细胞及其亚群表达谱的差异，本文就此进行探讨。

1 资料与方法

1.1 研究对象

分层随机选取2016年1月至2017年12月在兰州大学第一医院门诊和住院的确诊为慢性乙型肝炎的患者375例，男260例，女115例，年龄18～60岁,所选患者病例完整。经临床和实验数据分析后，确定慢性乙型肝炎携带者并且丙氨酸氨基转移酶(alanine aminetransferase ALT)正常的124例 (ALT<40 U/L)， 其中B基因型61例，C基因型63例；ALT≥正常上限，且<2倍增高的慢性乙型肝炎患者127例 (40 U/L≤ALT<80 U/L)， 其中B基因型65例，C基因型62例；ALT大于等于正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者124例 (ALT≥80 U/L)，其中B基因型63例，C基因型61例,各组B/C基因型的病毒载量差异无统计学意义。分别观察在不同组别中B/C基因型的乙型肝炎病毒对T淋巴细胞总数、辅助/抑制性T淋巴细胞(T helper /inhibition lymphocyte，Th/i)、抑制/细胞毒性T淋巴细胞 (T inhibition/cytotoxic lymphocyte, Ti/c)、辅助性/细胞毒性T淋巴细胞(T helper / cytotoxic lymphocyte, Th/c)，以及血清中白细胞介素(interleukin，IL)-2、干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、IL-4 和IL-10的影响。慢性乙型肝炎的诊断标准符合2010年慢性乙型肝炎防治指南《病毒性肝炎防治方案》[1]。同时排除妊娠期妇女、中度和重度脂肪肝患者、酒精肝患者、药物性肝损伤患者、自身免疫性肝损伤患者、曾经接受过抗病毒治疗的患者，以及合并其他肝炎感染的患者和并发其他心血管、肾脏等重大脏器病变患者。研究对象包括患者和健康人均签署知情同意书，本试验获得兰州大学第一医院伦理委员会批准。

1.2 仪器和试剂

荧光定量PCR分析仪购自德国 Lightcycler ROCH公司；流式细胞仪(FACS Calibur)及配套试剂购自美国BD公司；AU400型全自动生化分析仪购自日本OLYMPUS公司；XE2100型全自动血细胞计数仪购自日本SYSMEX公司。

乙型肝炎抗原和抗体定量检测试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司，乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒、乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒均购自深圳匹基生物工程有限公司，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10细胞因子检测盒均购自晶美生物技术有限公司。

1.3 方法

乙型肝炎抗原和抗体定量检测：采集患者静脉血并分离血清，按化学发光免疫分析仪的操作步骤进行样本检测。

乙型肝炎病毒DNA检测：采集患者静脉血并分离血清，按乙型肝炎病毒 DNA 定量检测试剂盒和基因扩增仪的操作步骤进行检测，敏感度>500 copies/mL。

乙型肝炎病毒基因分型：采集患者静脉血并分离血清，按乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒和基因扩增仪的操作步骤进行实时荧光定量聚合酶链式反应检测。

外周血细胞分类计数：无菌操作采集静脉血 2～3 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝，用XE2100型全自动五分类血细胞分析仪进行淋巴细胞计数检测。

CD3、CD4、CD8 单抗标记的制备：取100 μL 乙二胺四乙酸二钾抗凝血加 20 μL 三色单克隆抗体(抗CD3 PE-CY5/抗CD4-FITC/抗CD8-PE)，阴性对照取 100 μL EDTA-K2 抗凝血加20 μL鼠抗人 IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE，混匀，室温放置20 min。加入Muti-Q-Prep 溶血仪处理，每份标本均设定测定管和阴性对照管。

淋巴细胞分类检测：用流式细胞仪 (FACS Calibur)检测淋巴细胞表面表达的 CD3、CD4及 CD8，结果以百分率(%)表示。

细胞因子检测：采集患者静脉血并分离血清，按IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10检测试剂盒的操作步骤进行酶联免疫吸附试验。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件，计量资料以均数±标准差来表示，采用独立样本的t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不同免疫阶段的B/C基因型乙型肝炎病毒对慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞及其亚群的影响是不相同的，由结果可见,在ALT正常组中，B/C基因型乙型肝炎病毒对T淋巴细胞及其亚群无明显区别，而在ALT异常组中，B/C基因型的乙型肝炎病毒对T淋巴细胞及其亚群的影响有明显区别，且以ALT≥正常上限2倍组中为甚，具体表现为在ALT≥正常上限、且小于2倍增高的慢性乙型肝炎患者组中，反映Th1型淋巴细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ,C基因型组中较B基因型组中有所升高，差异有统计学意义，而其他指标差异无明显统计学意义，而在ALT≥正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者组中，B/C基因型乙型肝炎病毒对T淋巴细胞及其亚群有明显影响。T淋巴细胞总数、Th/i淋巴细胞在C基因型中较B基因型少，Ti/c淋巴细胞在C基因型中较B基因型多，Th/c比值在C基因型中较B基因型下降明显，C基因型甚至出现倒置。在Th细胞亚群方面，反映Th1型细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ，C基因型中较B基因型中明显升高，而反映Th2细胞的细胞因子IL-4、IL-10，C基因型中较B基因型中明显下降(表1～3)。

3 讨论

乙型肝炎病毒已发现有A～I 9个基因型，在我国以C基因型和B基因型为主。乙型肝炎病毒基因型和疾病进展及干扰素治疗效果有关，与C基因型感染者相比，B基因型感染者较早出现乙型肝炎e抗原血清学转换，较少进展为肝硬化和原发性肝细胞癌，并且乙型肝炎e抗原阳性患者对干扰素治疗的应答率高于C基因型[2-3]，但是其原因鲜见探讨。同时慢性乙型肝炎患者可处于不同的病变阶段，具体分为免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低 (非) 复制期以及再活动期，在不同阶段，免疫反应是不同的[4-5]，可表现为免疫耐受和免疫应答。当机体处于免疫耐受状态，机体不发生免疫应答，多成为无症状携带者，ALT水平正常，肝组织学无明显异常并可维持数年甚至数十年。但当机体处于免疫应答状态时，常伴有ALT持续或间歇升高，肝组织学中度或严重炎症坏死，肝纤维化可快速进展，部分患者可发展为肝硬化和肝衰竭[4,6]。同时临床上又经常以ALT≥2倍正常上限作为抗病毒治疗的一个常用标准，因此本研究以此为节点，分析不同ALT状态下病毒载量与机体免疫反应的关系。乙型肝炎病毒感染人体后，机体主要依靠细胞毒效应与非细胞毒效应两种免疫机制清除病毒，其中T淋巴细胞参与的细胞毒效应起主导作用[7-8]，T淋巴细胞依据表面分化抗原分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，T淋巴细胞中的 CD4+细胞通过分泌细胞因子，促进特异性B细胞和细胞毒性T淋巴细胞成熟和增殖，具有较强的抗病毒效应，CD8+细胞通过细胞溶解或非溶解机制来清除病毒。Th细胞又依据分泌细胞因子的不同分为Th1亚群和Th2亚群，同时有文献显示在乙型肝炎病毒感染机体后出现Th细胞亚群的异常[9-10]，但是目前鲜见有文献探讨在不同免疫阶段不同基因型的乙型肝炎对T淋巴细胞及其亚群的影响。本研究主要通过比较分析不同基因型的乙型肝炎病毒在不同免疫阶段其T淋巴细胞和亚群的差别，来探讨B/C基因型的乙型肝炎病毒对患者临床表现及治疗预后差别的重要原因。

表2 ALT≥正常上限、且<2倍增高的慢性乙型肝炎患者组中B/C基因型的免疫功能状态(n=127)Table 2 Immune function in ALT greater than or equal to the upper limit of normal, and less than 2 times higher than the upper limit of normal type B and type C genotypes chronic hepatitis B patients (n= 127)

表3 ALT≥正常上限2倍增高的慢性乙型肝炎患者组中B/C基因型的免疫功能状态(n=124)Table 3 Immune function in ALT greater than or equal to 2 times higher than the upper limit of normal type B and type C genotypes chronic hepatitis B patients (n= 124)

本研究结果显示在不同免疫阶段B/C基因型乙型肝炎病毒对慢性乙型肝炎患者T淋巴细胞及其亚群的影响是不相同的。在ALT正常组中，B/C基因型乙型肝炎病毒对T淋巴细胞及其亚群无明显区别，这可能是因为在此阶段机体大致处于免疫耐受阶段，病理性的免疫反应尚不强烈，即使乙型肝炎病毒基因型不同，它们引起的病理性免疫反应尚无明显差别[9]，而在ALT异常组中，B/C基因型的乙型肝炎病毒对T淋巴细胞及其亚群的影响有明显区别，且以ALT≥正常上限2倍组中为甚。据现有文献推测认为，机体感染乙型肝炎病毒后，会引起机体免疫功能的紊乱，结合本研究结果认为机体感染乙型肝炎病毒后，特别是在免疫应答阶段，T淋巴细胞下降，并且以C基因型为甚，这说明C基因型乙型肝炎病毒感染人体后对机体有一定的免疫抑制作用，特别是对 CD4+T淋巴细胞有一定抑制作用，这点也说明C基因型乙型肝炎病毒感染人体后病毒很难被清除，因而引起的病理损伤较B基因型强烈[11]。在免疫应答阶段，B/C基因型的乙型肝炎病毒对 CD4+T淋巴细胞亚群的研究结果提示乙型肝炎病毒感染机体后引起 Th1、Th2细胞之间的不平衡，Th1、Th2应答之间的平衡是维持正常免疫反应的重要环节, 在清除病毒和肿瘤、诱导免疫耐受等方面起着关键性作用[10]。本研究中反映Th1细胞的细胞因子IL-2、IFN-γ在C基因型中较B基因型中明显升高，Th1细胞的诱导分化与病毒清除有关，并同时与肝组织的病理损伤相关，据此推测Th1细胞的增高导致C基因型乙型肝炎病毒感染人体后较B基因型病情发展迅速，且难以治疗，而反映Th2细胞的细胞因子IL-4、IL-10，在C基因型中较B基因型明显下降。Th2细胞的诱导分化能抑制 Th1细胞的分化，导致乙型肝炎病毒感染的慢性化，又有利于防止 Th1细胞应答过度而造成的病理损伤，这也反映了C基因型乙型肝炎病毒感染人体后，病情更容易慢性化且难以治愈，并且病情的发展较B基因型迅速、难治[12]。

综上所述，B/C基因型的乙型肝炎病毒在不同免疫阶段对机体T淋巴细胞及其亚群的影响是不同的，对其差异性的对比分析可以进一步帮助了解B/C基因型的乙型肝炎病毒在病情进展、预后、治疗等方面的差异。