实验室筛查与诊断新技术在遗传代谢病中的应用*

张潇分，王燕敏，田国力(上海市儿童医院&上海交通大学附属儿童医院筛查中心，上海 200040)

遗传代谢病又称先天性代谢异常(inborn errors of metabolism，IEM或inherited metabolic diseases，IMD)，是一大类有代谢功能缺陷的复杂遗传病，涉及氨基酸、有机酸、脂肪酸、尿素循环、碳水化合物、类固醇、金属、溶酶体等多种物质代谢障碍的疾病，主要由于基因突变导致机体生化代谢紊乱或酶活性改变，代谢产物蓄积，具有高度的遗传异质性[1]。研究表明，大多数IEM属于单基因遗传病，以常染色体隐性遗传或X-连锁隐性遗传为主[2]。IEM临床表型广泛且通常是非特异性的，并且症状的出现可发生于从胎儿到成年的任何年龄，尽管单一病种发病率较低但总体发病率较高，因此，IEM严重影响着人口的素质和生存质量。目前许多IEM可防、可治，饮食治疗、药物治疗、手术治疗及基因治疗等可不断改善部分患者的预后。对高危患儿进行IEM筛查，能够及时对疾病做出早期诊断，为患儿的治疗、遗传咨询等方面提供个体化方案。

目前IEM实验室检测技术包括酶联免疫法、荧光法、气相色谱质谱技术(gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS)、串联质谱技术(tandem mass spectrometry，MS/MS)及下一代测序技术(next-generation sequencing, NGS)等[3]。随着分子诊断学、分子遗传学及基因测序、数字微流体等技术的快速发展，IEM的筛查与检测取得了巨大成效。本文主要综述了实验室筛查与诊断技术在遗传代谢病中的应用。

1 质谱技术

质谱技术主要是物质被电离成具有不同质荷比(m/z)的带电粒子，这些带电粒子根据m/z的大小在空间或时间上分离，形成图谱，通过测定离子峰的强度来确定化合物的分子质量、分子结构和样品浓度。目前，IEM的筛查与诊断中常用的质谱技术有GC/MS、MS/MS及其他质谱技术等。

1.1GC/MS GC/MS是由色谱分析仪和质谱分析仪两部分组成，它通过气相色谱仪将混合物中的组分分离后再通过质谱仪对分离的组分进行鉴定(定性分析)以及计算出精确的量(定量分析)。由于IEM中异常的代谢物质主要通过尿液排泄，因此，检测尿中特征性代谢产物的种类和含量的变化，能够为IEM的诊断提供可靠的依据。GC-MS技术具有高灵敏度、高特异性、高分离度、数据处理自动化、一次可检测多种异常代谢产物等优点，可以从尿液中检测出132种有机酸，用于40多种代谢病的诊断，是目前常用的遗传代谢病检测方法之一。

自1966年Tanaka报道通过气相色谱质谱联用仪发现首例异戊酸血症以来，GC-MS在遗传代谢病的筛查与诊断中广泛应用，并成为有机酸尿症的主要诊断方法[4]。罗小平等[5]在2003年时将GC/MS技术引入国内。田国力等[6]采用GC-MS技术对5 778例遗传代谢病高危儿尿液中132种代谢产物进行检测，共有106例患儿被明确诊断出17种疾病，证实了GC-MS技术对有机酸代谢异常和部分氨基酸代谢异常诊断具有特异性。

尿液作为最常用的生物基质之一，具有无创性、背景物质少等优点，由于尿代谢产物受多种因素如饮食、饮水量或疾病状态等影响，故而GC/MS检测尿有机酸存在一定的假阴性。另外，采用GC-MS技术对尿有机酸进行检测需对样本进行前处理，且样本前处理步骤多，一份样本检测需要1 h，因此不适合使用GC-MS对大规模患者人群进行筛查，但该技术仍然是目前最常用的遗传代谢病检测方法之一。

1.2MS/MS MS/MS由2个质谱仪经1个碰撞室串联而成，理论上2～3 min内可对1个3 mm滤纸干血片上几十种代谢产物进行分析，判断数十种氨基酸、有机酸、脂肪酸氧化代谢紊乱的疾病，实现了“1次实验检测多种疾病”[7]。样本采用滤纸干血片，通过盐酸正丁醇衍生法及非衍生法2种样本处理方法，对血中氨基酸及酰基肉碱水平进行检测，具有高灵敏性、高特异性、快速、高通量的特点。顾学范等[8]于2002年通过MS/MS对遗传代谢病进行筛查及检测。Céspedes等[9]采用串联质谱法确定哥伦比亚新生儿血液中氨基酸和酰基肉碱的浓度水平，并建立参考区间以进一步用于IEM诊断，表明该技术在IEM筛查方面具有较高的精确性、准确性。除小分子物质外，目前MS/MS还可对一些大分子物质如溶酶体贮积症(lysosomal storage disease，LSDs)、线粒体疾病等进行检测[10]。串联质谱技术已经发展成为遗传代谢病筛查中应用广泛的分析技术。在我国，MS/MS已用于新生儿氨基酸代谢障碍、有机酸血症及脂肪酸氧化代谢障碍等遗传代谢病筛查[11]，并形成了新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识[12]。在IEM的诊断方面，通过MS/MS分析高危患儿血液中的氨基酸和酰基肉碱分布也得到了广泛应用[13]。

MS/MS也具有一定的局限性，一方面质谱仪价格昂贵，另一方面MS/MS是一项非常复杂的系统，需要专业的技术人员来操作，实验室质量控制要求高，同时也需要经验丰富的医师结合临床或其他辅助诊断对结果进行正确判读,将MS/MS与其他生化指标如酶学测定和分子生物学技术联合应用也可帮助临床医生准确诊断患有可疑IEM的患儿。

1.3其他质谱技术 近年来，已经开发出商业化的超高性能超临界流体色谱-串联质谱(ultra-high performance supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry，UHPSFC-MS/MS)系统[14]。该系统能将气相色谱(gas chromatography，GC)的分辨率与超高效液相色谱(ultra-high performance liquid chromatography，UHPLC)的高通量功能结合在一起，已用于临床上类固醇激素的检测，这项新技术由于其复杂性，尚未完全应用于IEM的实验室筛查及诊断。

2 分子诊断技术

体内的生化代谢物在疾病状态和环境等因素的作用下，浓度水平会有所波动，在检测过程中会有一些假阳性率和假阴性率的存在。基因突变检测相对于代谢物检测，结果更为可靠，诊断价值更高。分子诊断技术对DNA序列或对拷贝数变异进行分析，找出基因病变的部位，不受生理状态和环境的影响，还能够进一步检测出家族中杂合子的携带者。因此，分子诊断在IEM的病因学诊断中占据重要地位[15]。目前IEM筛查的分子诊断技术主要包括PCR技术、基因芯片技术、高通量测序等。

2.1PCR技术 PCR技术包括高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting analysis，HRM)、多重连接依赖式探针扩增分析(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)等。HRM可以对超长脂酰辅酶A脱氢酶缺乏等已知突变或热点突变进行检测，是一种敏感性强、特异性高的检测技术，目前已用于多种IEM基因突变的检测[16]。孙婧婧等[17]采用HRM技术快速诊断1例瓜氨酸血症Ⅰ型患儿的ASS1基因纯合突变。Islam等[16]使用酶法和HRM分析法对63例临床可疑女性进行了G6PD状态评估，结果发现除了G6PD酶测定，HRM曲线分析可作为对G6PD杂合子有效补充分析方式。

此外，MLPA可以对染色体异常或基因的拷贝数变异进行分析(如复制或缺失)，检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNPs)和点突变，对mRNA进行量化。目前可应用于众多研究领域，如先天性肾上腺皮质增生症、苯丙酮尿症、假性甲状旁腺机能减退、丙酸血症等[18-19]。MLPA是一种具有高灵敏度、高特异性、高通量的检测技术，具有准确性高，重复性好的特点。Nagasaki等[20]通过MLPA技术对1例有神经肌肉症状的假性甲状旁腺功能减退症Ib型(PHP-Ib)患者GNAS基因进行检测，结果发现其GNAS基因外显子A/B的甲基化缺陷并涉及GNAS邻近基因STX16外显子4～6的微缺失，表明MLPA是筛查临床非典型症状患者GNAS突变的有效工具。

2.2基因芯片技术 染色体微阵列芯片分析(chromosome microarray analysis，CMA)即染色体基因组芯片，也称基因芯片技术。与传统遗传学检测方法相比，基因芯片技术具有高通量的特点，它能够在1张芯片上对整个基因组的基因拷贝变异(copy number variations，CNVs)进行检测。同时，基因芯片检测效率较高，能够检测小于1×105bp甚至1×103bp的拷贝数变异。由于IEM种类繁多，50%～70%的IEM发生在儿童，以智力发育迟缓合并其他组织器官异常多见，临床表现复杂。目前基因芯片技术在不明原因的儿童发育迟缓、智力落后、多发畸形等方面的临床应用已获得美国FDA批准，在该方面的应用相对成熟[21]。近几年，我国CMA的临床应用逐步推广，为众多遗传病患者提供了精确分子诊断，形成了CMA在儿科遗传病的临床应用专家共识，共识中对具有以下临床表型的疾病，建议将CMA作为一线检测手段，包括：(1)不明原因的智力落后和(或)发育迟缓；(2)非已知综合征的多发畸形；(3)自闭症谱系障碍。

2.3Sanger测序 Sanger测序技术属于经典的基因诊断技术，能够将基因中部分小片段的插入/缺失突变以及大部分的点突变检测出来。是目前在IEM实验室筛查与诊断中应用最为广泛、最成熟的分子诊断技术。谢波波等[22]采用Sanger测序对1例瓜氨酸血症Ⅰ型进行家系基因检测，并对ASS1基因14个外显子进行DNA测序，检测到患儿存在c.951delT(F317LfsX375)和c.1087C >T (R363W)2个杂合突变，并阐明其病因，为该病的诊断和遗传咨询提供依据。但由于Sanger测序技术通量不足，检测范围有限，使其在应用上还存在一定的局限性。

2.4NGS NGS能够在一次实验中快速完成对个体的全基因组测序，检测单个个体全部的DNA序列，对DNA序列的点突变、重复、缺失及序列多态性等进行揭示，相对于传统的Sanger测序技术，具有高灵敏度、高通量，低成本的优势，在单基因遗传病的基因筛查和诊断中具有广阔的临床应用前景。NGS技术按测序目标序列的大小，可分为全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)和靶向重测序。靶向重测序又可分为全外显子组测序(whole exome sequencing，WES)、临床外显子组测序(medical exome sequencing，MES)、靶向疾病基因包(Panel)等。基于下一代测序技术，特别是利用WES和WGS 两种方法发现基因变异，被越来越多的应用于IEM的筛查与临床诊断中。近年来，利用NGS技术进行IEM分子诊断的研究获得越来越多的关注。目前，已建立了针对脂质沉积性肌病[23]、溶酶体贮积病[24]、婴儿型线粒体疾病[25]、先天性糖基化缺陷病[26]等疾病的分子诊断方法，取得了良好的效果。

有学者采用NGS技术对72例高危患儿进行WES，共发现了98个不同的突变，其中27个未见报道，其还发现43.06%(31/72)的患儿患有11种常见疾病，其中多数是IEM和神经遗传性疾病[27]。Yang等[28]应用WES技术对250个不同表型的遗传性疾病患者进行了检测，结果发现至少有25%的患者得到明确的基因诊断。Lindstrand等[29]对高危患儿IME的诊断使用短读WGS，结果发现相比于临床染色体微阵列分析(CMA)，其总体诊断率提高了27%，使用WGS还可以高精度检测到各种结构变异(structural variant，SV)，由于WGS数据可以分析单核苷酸变异(single nucleotide variants, SNV)，单亲二倍体(uniparentaldisomy，UPD)和短串联重复序列(short tandem repeat，STR)，故而在临床诊断实验室中常用于综合基因测试。

NGS技术已成为目前诊断IEM新致病基因的重要研究工具。但由于NGS技术还在发展中，临床应用的时间也较短，对于新发现的DNA突变需进一步验证，对于意义不明的新突变亦需进一步进行功能学的研究，确定其是否具有临床意义。对于某些DNA变异，其致病性不能确定；对于查出的一些致病基因，患儿会何时发病也不能确定；发病后何时干预以及如何进行干预、如何做好遗传咨询；建立实验室标准化操作；以上都会给NGS技术在IEM中的全面应用带来极大的挑战。

3 数字微流体技术

数字微流控技术(digital microfluidics，DMF)是一种新兴的液体处理技术，可以在软件控制下将液体作为离散的微滴进行处理。这些皮升至微升大小的液滴，每个都可以作为化学反应的微容器，使流体在其中分配、运输、混合、孵育和检测。

DMF技术是一种经济高效的新平台，目前用于IEM实验室筛查的免疫测定和酶活性测定方法都可以在一次性微芯片上进行。将DMF技术和纳米电喷离子化MS/MS结合使用,可将样本提取、衍生化和代谢物分析整个过程集中在1个芯片上，整个过程中消耗的样品和试剂大约是等效台式测定所需的样品和试剂的1%，很大程度上增加检测通量，减低检测成本[30]。高通量DMF平台(又称为SEEKER)最近获得了美国FDA的授权，该平台可以针对4种溶酶体酶进行多重测定，可以同时筛查包括Ⅰ型粘多糖贮积病(mucopolysaccharidosis type I，MPSI)、庞贝氏症(Pompedisease)、戈谢病(Gaucherdisease)和法布里病(Fabry)在内的4种溶酶体贮积病(lysosomal storage disorders，LSD)，并且已经加入了美国新生儿筛查计划中[31]。除了免疫学和酶学检测，还可使用基于DMF的微芯片和控制设备对DNA进行扩增。有学者通过基于DNA方法的DMF技术对T细胞受体切除环(T-cell receptor excision circles，TREC)进行检测，以筛查新生儿或高危患儿重症联合免疫缺陷(severe combined immune deficiency，SCID)[32]。以上方法表明，DMF技术在IEM筛查和检测中具有较大的临床应用潜力。

4 结语

个体化医疗与精准医疗的快速发展很大程度上依赖于准确、可靠的检测结果。高新检测技术如质谱技术、分子诊断技术和微流体技术有望在IEM实验室检测领域带来革命性的变化。随着IEM各种诊断新技术的快速发展，将规范化、标准化贯穿于整个检测过程，才能最大程度上使新技术在IEM检测中获得收益，临床医师也应提高对结果的正确解读能力。目前来讲，将各种筛查技术联合应用可对IEM进行全面检测，能显著提高灵敏度及特异性，避免单一方法的漏诊，这也是未来的发展方向之一。