超高压处理对苦杏仁分离蛋白结构和致敏性的影响

朱乾乾， 陈静静， 张 涛， 江 波*

（1.食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122；2.江南大学，食品安全国际联合实验室，江苏 无锡214122）

食物过敏是由于进食含有过敏原的食物引起的免疫反应。症状主要包括皮肤瘙痒、咳嗽、恶心、呕吐等。引起食物过敏的食品主要包括奶类、禽蛋类、鱼类、甲壳类、花生、大豆、坚果类和小麦[1]。预防食物过敏的最好方式就是完全避免接触过敏食物。与此同时，越来越多的研究人员致力于通过食品加工过程来消除或减少食物中的过敏原。大部分过敏原是蛋白质，加工处理会掩盖或展开引起过敏的抗原表位，从而降低或提高对抗原的识别，进而改变过敏性食物的致敏性。迄今为止，用于消除食物致敏原的加工技术有热处理、美拉德反应、发酵、辐射、酶法水解和超高压技术[2]。超高压技术是一种替代性食品保存技术，具有保留食品感官和营养品质的特性。通过高压使蛋白质结构破裂或形成非共价键、静电相互作用、疏水相互作用和氢键改变蛋白质结构，也可以诱导形成新的二硫键来稳定变性蛋白或使蛋白质聚集[3]。近年来，利用超高压技术降低或消除食品致敏性的报道较多，例如利用超高压技术来降低牛奶、大豆、花生等食品的致敏性[4]。

苦杏仁是一种富含必需脂肪酸、蛋白质、膳食纤维和其他功能性成分的坚果，油脂质量分数为45%～50%，蛋白质23.6%～26.2%，苦杏仁苷约为3%[5]。据报道，苦杏仁在我国新疆、河北和山东等地种植面积广，资源丰富，2016年产量达2.6×106吨。现代医学研究表明，苦杏仁具有止咳、祛痰的功效[6]。杏仁乳是由杏仁和水均质获得的胶体分散体系，近年来，杏仁乳被作为乳糖不耐症人群的替代乳品，在市场上广受欢迎。但苦杏仁含有和美国大杏仁almond相同的过敏原成分amandin[7]。二维电泳结果显示，美国大杏仁almond种子含有188种不同的蛋白质[8]。据世界卫生组织和国际免疫学会联盟过敏原命名小组委员会报道，美国大杏仁almond中含有5种 过 敏 原，命 名 为Prudu 3、Prudu 4、Prudu 5、Prudu 6和Prudu 8。Prudu 6是11S类大豆球蛋白，相对分子质量约为3.6×105，被称为amandin，是美国大杏仁almond最主要的过敏原成分。

国外关于美国大杏仁almond过敏性的研究，主要有热加工、辐射和超高压处理。辐射处理不能改变almond杏仁蛋白结构及其致敏性，辐射处理和高压灭菌，也不能明显地改变almond杏仁蛋白的结构和致敏性[9]。almond杏仁过敏原热稳定性好，且不受辐射处理的影响。Li等人通过多克隆抗体的ELISA实验证明，超高压处理对almond杏仁致敏性没有影响，但Santosh Dhakal等人通过amandin的4C10（构型表位）和4F10（线性表位）表位分别制备的抗体，证实超高压能够降低美国大杏仁almond的致敏性。在450、600 MPa，30℃处理600 s，4C10相关表位的免疫反应性低于5%，4F10相关表位的免疫反应性大约为50%[10]。而关于超高压处理对苦杏仁分离蛋白结构和整体致敏性影响等方面的研究比较少。作者研究不同超高压强度处理对苦杏仁分离蛋白分离物结构和致敏性的影响，以期为超高压处理在食品致敏性方面的应用提供理论参考和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦杏仁种子：市售；丙烯酰胺、N-N-亚甲基双丙烯酰胺和四甲基乙二胺：生工生物工程（上海）股份有限公司产品；福林酚、8-苯胺-1-萘磺酸铵盐：美国Sigma-Aldrich产品；杏仁过敏原ELISA试剂盒：德国Pribolab公司产品；其他化学试剂均为分析纯产品。

1.2 仪器与设备

超高压设备：包头九久科技发展有限公司产品；紫外可见分光光度计：岛津（上海）有限公司产品；圆二色谱：英国应用物理公司产品；F-7000荧光分析仪：日本日立公司产品。酶标仪：美国Molecular Devices公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 苦杏仁分离蛋白的制备

1）脱脂：将苦杏仁浸泡20 h，去皮，40℃真空干燥10 h。研磨成粉末，以1 g∶10 mL的比例加入丙酮，磁力搅拌2 h进行脱脂，重复3次。在通风橱中过夜蒸发剩余丙酮，研磨均匀。

2）苦杏仁分离蛋白的提取：以1 g∶10 mL的比例加入pH 8.1的20 mmol/L Tris-HCl的溶液，4℃磁力搅拌2 h，重复两次，提取粉末中的苦杏仁分离蛋白分离物。8 000g离心20 min，取上清液，过0.45μm纤维素膜[11]。

1.3.2 苦杏仁分离蛋白质量浓度测定 通过福林酚法测定提取液中苦杏仁分离蛋白的质量浓度[12]。取1 mL分离蛋白溶液，与5 mL溶液A和溶液B的混合液（体积比1∶1）反应10 min，再加入0.5 mL的福林酚溶液反应30 min，在650 nm处测定吸光度值。以牛血清蛋白为标样制定标准曲线，R2=0.99。用pH 8.1的20 mmol/L Tris-HCl的溶液将其稀释为2 mg/mL，为后面的实验定量。

1）溶液A：准确称取10 g碳酸钠，2 g氢氧化钠和0.25 g酒石酸钾钠溶于500 mL去离子水中。

2）溶液B：准确称取0.25 g五水合硫酸铜溶解于50 mL去离子水中。

1.3.3 超高压处理 取5 mL溶液置于超高压设备腔体中，自动升压至所需压力。加压结束后，瞬间降压，取出样品，立即放入冰中保存。在100～500 MPa下处理900 s，研究不同强度的高压处理对苦杏仁分离蛋白的影响。在500 MPa下处理0～900 s，研究不同加工时间对苦杏仁分离蛋白结构和性质的影响。加压处理在常温（25℃）条件下进行。

1.3.4 远紫外圆二色光谱的测定 将处理前后的苦杏仁分离蛋白溶液样品稀释为0.05 mg/mL，将溶液置于1 mm的石英比色皿中，样品的扫描波长范围195～260 nm，扫描3次取平均值，步进分辨率为1 nm，采集时间为1 s，带宽为1 nm，需扣除蛋白溶解缓冲液的背景。在计算中假设氨基酸残基均值为900，圆二色性以残基摩尔椭圆率表示，二级结构组成通过系统自带的CDMN软件分析。

1.3.5 外源荧光光谱的测定 将处理前后的苦杏仁分离蛋白溶液样品稀释成0.20 mg/mL，取20μL的ANS溶液（8.0 mmol/L溶于20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1））加至4 mL的样品溶液中，混合均匀，立即在激发波长为550 nm，发射波长为500～850 nm，狭缝为2.5 nm条件下扫描其荧光光谱[13]。

1.3.6 表面疏水性指数（H0）测定 将苦杏仁样品稀释成0.005～0.20 mg/mL的溶液[14]。然后将20 μL的ANS溶液（8.0 mmol/L溶于20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1））加至4 mL的样品液中，混合均匀，立即在激发波长550 nm，发射波长549 nm，狭缝为2.5 nm的条件下测定其荧光强度。荧光强度相对于蛋白质量浓度的初始斜率，被定义为蛋白表面疏水性指数（H0）。

1.3.7 SDS-PAGE采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对超高压处理前后的苦杏仁分离蛋白组分进行分析[6]。电泳分离胶质量浓度为12 g/dL，浓缩胶质量浓度为4 g/dL。将样品与缓冲液以体积比1∶4混合，沸水浴煮沸10 min后上样，电压为120 V。电泳完毕，采用考马斯亮蓝染色液G-250染色2 h，过夜脱色后进行凝胶成像。

1.3.8 苦杏仁分离蛋白致敏性的测定 处理前后样品的致敏性通过杏仁过敏原ELISA试剂盒进行检测[15]。取100μL上清液加到96孔酶标板，室温下孵育20 min。然后每孔加入300μL洗涤缓冲液清洗3次，用力甩干。每孔加入100μL培养物（苦杏仁过氧化物酶）到每孔中，室温下培育20 min，如前洗涤3次。每孔加入100μL培养基溶液，室温下允许暗处反应20 min。每孔添加100μL停止液（0.5 mol/L H2SO4）终止酶反应。测定其在450 nm波长处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对苦杏仁分离蛋白二级结构的影响

超高压处理苦杏仁分离蛋白的圆二色谱图如图1所示。苦杏仁分离蛋白的二级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲组成。208 nm和222 nm处出现负峰，表明α-螺旋的存在；218 nm处出现宽的负峰，表明β-折叠的存在。圆二色谱图显示，随着超高压处理强度逐渐增加，处理前后苦杏仁分离蛋白样品的负峰对应波长维持不变，负峰强度基本没有发生变化，表明α-螺旋和β-折叠的含量不变。通过CDMN软件分析组分含量，与图谱显示信息一致。研究结果显示，超高压处理不影响蛋白样品的二级结构，该处理方法对苦杏仁分离蛋白二级结构的构成所引起的致敏性没有显著影响。

图1 超高压处理对苦杏仁分离蛋白圆二色谱图的影响Fig.1 CD results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to different pressure treatments under the same processing time

2.2 超高压处理对苦杏仁分离蛋白三级结构的影响

图2 描述了不同强度超高压处理以及500 MPa处理不同时间对应的苦杏仁分离蛋白荧光光谱图。由图可知，当超高压处理的时间固定为900 s时，随着压强的增加，苦杏仁分离蛋白在波长为500～850 nm的范围内，荧光强度增加，压强达到500 MPa时，荧光强度显著增加，表明苦杏仁分离蛋白的疏水区域增加。另外，当压强固定为500 MPa时，随着加压时间的增加，荧光强度逐渐增加。在较高压强与较长时间的条件下，超高压处理可能导致疏水性基团的暴露，改变苦杏仁分离蛋白的三级结构，影响苦杏仁分离蛋白的构型表位，进一步降低或增加苦杏仁分离蛋白致敏性。

2.3 超高压处理对苦杏仁分离蛋白表面疏水性的影响

为进一步研究超高压处理对苦杏仁分离蛋白三级结构的影响，证明荧光强度的增加是由于疏水性基团暴露所引起的，作者研究了不同压强、时间处理后苦杏仁分离蛋白的表面疏水性变化，结果如图3所示。表面疏水性通常被用作蛋白构象改变的探针。100～400 MPa处理900 s时，苦杏仁分离蛋白的表面疏水性没有发生明显变化，当压强达到500 MPa时，表面疏水性显著增加。在500 MPa的强度下处理不同时间，随着加压时间的增大，表面疏水性逐渐增大。表面疏水性的变化趋势表明超高压处理导致蛋白结构的展开，使内部疏水区域暴露，从而增强了表面疏水性强度。

图2 不同压强处理900 s和500 MPa处理不同时间对苦杏仁分离蛋白荧光光谱的影响Fig.2 Fluorescence spectroscopy results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa pressure treatment for 900 s

图3 不同压强处理900 s和500 MPa处理不同时间对苦杏仁分离蛋白表面疏水性的影响Fig.3 Surface hydrophobicity results of bitterapricot kernelproteinisolate that were subjected to 500 MPa pressure treatment for 900 s

2.4 超高压处理对苦杏仁分离蛋白SDS-PAGE的影响

在非还原电泳中，苦杏仁主要蛋白amandin主要由相对分子质量为61 000和63 000的多肽组成。每个多肽都由一个酸性亚基（42 000～46 000）和一个碱性亚基（20 000～22 000）组成，亚基之间通过二硫键相连[19]。在存在还原剂的条件下，amandin的SDS-PAGE图显示相对分子质量为44 000、42 000、28 000的条带或41 000、39 000、22 000和21 000大小的条带。超高压处理前后杏仁蛋白的SDSPAGE结果如图4所示，未处理杏仁蛋白（通道0）的泳道中可以清晰地看到61 000、63 000、41 000和39 000的多肽条带，在100～400 MPa处理900 s时，苦杏仁分离蛋白的条带没有发生明显变化；当超高压的强度为500 MPa，处理900 s时，伴随有大相对分子质量条带的减弱，以及小相对分子质量条带的形成。SDS-PAGE图也显示500 MPa处理0～300 s时，多肽条带不会改变；当处理600、900 s时，61 000和63 000的条带强度减弱，伴随有约45 000大小的条带生成，可能是由于苦杏仁分离蛋白的不完全裂解造成的。结果与Sathe等人结果一致，他们认为在450～600 MPa压力强度处理时，杏仁蛋白amandin相对分子质量为61 000和63 000的条带逐渐减弱，伴随着20 000和40 000条带的生成[10]。超高压处理可能使蛋白质结构展开，导致二硫键的断裂或重组。

图4 不同压强处理900 s和500 MPa压力下处理不同时间对苦杏仁分离蛋白SDS-PAGE的影响Fig.4 SDS-PAGE results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa for 900 s

2.5 超高压处理对苦杏仁分离蛋白致敏性的影响

图5 显示超高压处理后苦杏仁分离蛋白的免疫反应性发生了变化，100～500 MPa处理900 s后，苦杏仁分离蛋白的致敏性逐渐降低。在500 MPa处理900 s的条件下，苦杏仁分离蛋白的致敏性可以降低到25.69%，所以在后续实验中采用此压力强度。由图可知，500 MPa处理0～900 s，杏仁蛋白的免疫反应性显著下降，900 s时免疫反应性的下降最为显著。苦杏仁分离蛋白经超高压处理后致敏性的下降，可能是由于超高压处理引起蛋白质构象的变化引起的。Li等认为超高压处理能够引起大豆蛋白结构的伸展与变性，也能引起蛋白质的解聚或聚合[17]。

图5 不同压强处理900 s和500 MPa处理不同时间对苦杏仁分离蛋白免疫反应性的影响Fig.5 ELISA results of allergens in bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa for 900 s

3 结语

超高压处理在降低食品的免疫反应性方面提供了潜在的能力，此处理方式对食品质量和营养特性不会产生不利影响。圆二色谱和荧光光谱结果表明，超高压处理不能显著改变苦杏仁分离蛋白的二级结构，但可以通过疏水性基团的暴露，增加杏仁蛋白质的表面疏水性，使蛋白质的三级结构展开，增强其荧光强度。超高压处理对苦杏仁分离蛋白三级结构的改变，可能破坏其构象表位，引起苦杏仁致敏性的变化。ELISA结果表明，500 MPa处理900 s，苦杏仁分离蛋白的免疫反应性可以降低至25.69%。总的来说，这项研究表明超高压技术可以作为降低食品致敏性的新型食品加工技术，用于改善苦杏仁产品的质量，增加其潜在的应用价值。