HIV实验室检验技术及效果分析

玉海玲

（广西南宁市第四人民医院，广西 南宁 530023）

艾滋病（AIDS）又称为获得性免疫缺陷综合征，是因为人感染了人类免疫缺陷病毒（HIV）所致，严重危害人类身体健康。检测HIV以利于尽早发现疾病，及时给予有效干预治疗，切断传播路径。自1981年发现艾滋病以来，艾滋病已从一种不可治愈的传染性和致死性极高的疾病发展成可以控制的慢性传染性疾病。

1 HIV抗体检测

一般情况下被病毒侵入2-12周，就会出现HIV抗体，从感染HIV病毒到血清中能检测出HIV抗体这段时间称之为窗口期[1]。随着医疗技术的快速发展，检测技术也得到很大更新发展，目前诊断早期HIV感染的主要方法还是血清HIV抗体检测。（1）初筛试验：临床检测HIV抗体的主要方法是酶联免疫吸附试验（ELISA）。第一代HIV抗体检测试剂是于1985年诞生，目前已发展到第四代。第一代ELISA检测试剂存在很多不足，比如：病毒抗原或病毒裂解物作为抗原包裹反应板，样品被不同程度的感染杂蛋白与宿主细胞，有着较高的假阳性率，如此以来，对评估HIV感染情况造成一定影响[2-3]。基因工程技术的发展推动诊断HIV技术更新，采用基因工程重组或人工合成肽为包被抗原，能同时检测HIV-1和HIV-2，特异性较第1代有了很大提高。早在上个世纪末， 第二代试剂就包括了gp36、gp42等抗原，基因有助于混合多种抗原，特性单一，对比第一代试剂，有着较高的特异性，并提高检出时间。第三代检测方法主要是双抗原夹心法，可以同时检测出IgM抗体，对比第二代试剂可以提前4-5 d检测出HIV抗体，目前已普遍应用于初筛HIV。第四代试剂可以同时检测出p24抗原与HIV抗体，更加提升检测特异度与敏感度，并提升明确窗口期比率[4]。尽管ELISA法检测效果取得显著上升，然而因为技术原因，难以排除相互干扰的可能性，对比分析单独抗原抗体，有着不高的灵敏性。伴随其他检测技术的出现与日臻完善，此方法可以大为提高综合检测HIV患者效率，这些新技术包括：时间分辨荧光免疫分析、化学发光免疫分析技术。（2）确认试验：HIV初筛试验会存在一些假阳性，样本经初筛试验结果呈阳性，还应当实施确认试验，对受检者的感染情况进行复查，排除误诊。①免疫印迹试验（WB）：此方法是确认HIV的唯一手段，并被认可为检验HIV病毒的金标准，与ELISA法相比，WB检测HIV不同的抗原组分，有着较高的特异度及灵敏度，然而此方法有着比较复杂的检测流程，且检测成本高，很多时候会因为误判与不按规程检测，会导致假阳性[5-6]。应用WB复检HIV初筛结果，有4%-20%阳性样本可能存在无法确定的情况，这主要与p24结合非特异性抗体存在关联，所以通常需要经验丰富的医师来确定检验结果[7]。②细胞免疫荧光检测（IFA）：此方法就是在特异性一抗与HIV感染细胞相结合的前提下，把用荧光标记的二抗与一抗相结合，染色呈阳性，就可确定为真阳性[8]。此方法操作流程便捷，对比ELISA法，有着更佳的特异性与灵敏度。但此法需要昂贵的荧光显微镜，需要接受良好训练的技术人员，观察和解释结果易受主观因素的影响，实验结果不宜长期保存，在判定检测结果时，有一些患者样本，因为存在非特异性荧光，从而对结果评估产生影响。故IFA不宜在一般的实验室开展和应用。③放射免疫沉淀试验（RIPA）：此方法的检测原理是当受检者血清中的HIV抗体结合同位素标记的HIV蛋白，与葡萄球菌蛋白A产生反应后，出现免疫沉淀物，利用放射自显影技术，观察有无同位素标记蛋白条带，最终确定感染切口[9-10]。此方法的特异度与灵敏度都较高，然而使用试剂流程复杂，再加上同位素放射性，对环境有污染风险，同时需要严格保护操作者，故阻碍了此方法的普遍推行。④化学发光免疫分析法。此检测方法是遵循发光强度与标准曲线，对待测物的含量进行检测，从而检测血液中HIV，可以于抗原上标记酶，或者于抗体上标记发光物质，进行免疫反应后，添加酶底物或氧化剂，从而对机体含量进行检测。此检测方法有着较长有效期限，不会造成污染，有着宽泛的线性领域与较高的灵敏度。⑤电化学发光免疫分析法（ECLIA）。此检测方法是综合各种技术而成的检测方法，包括磁性微珠包被技术、生物素-亲和素技术、电化学发光技术等，有着较高灵敏性，可以大幅度降低批内、批间的误差，以提供更为精准的检测结果。此方法于封闭且流动系统内进行检测，可以较好防止发生交叉污染，试剂的稳定性高，结果更具可靠性。此方法最大特点为可以有效压缩分析时间，只要20 min，比酶联免疫吸附法检测速度更快。临床研究发现，ECLIA还有一个特点是对比酶联免疫吸附法，ECLIA检测线性领域超出4个数量级，从而更好防止出现因前带倒钩所致的假阴性现象，此方法有着较好的稳定性与重复性，能够进行批量化分析，大大压缩诊断窗口期。然而此法有着较高成本，目前还无法推广至基层医院。

2 病原学检验

临床常用的HIV病原学检验方法主要有以下：p24抗原检验、病毒分离培养、核酸检验。（1）病毒分离培养：此种检验手段主要用于筛选抗病毒药物、取得原始临床毒种，同时可以对半数抑制药物浓度与细胞半数感染单位进行确定[11]。评估是否感染HIV最精准的手段就是病毒分离培养，然而此方法因为影响因素较多，故不宜运用于常规诊断。病毒分离培养最普遍使用的方法就是共同培养HIV-1感染者的靶细胞与PBMCS[12]。然而，目前在我国HIV-1分离成功率较低。HIV-1分离会受到以下因素的影响：病程发展、靶细胞种类、靶细胞活化状况、病毒载量、CD4 T淋巴细胞、辅助受体表达水平等，选择共同培养多人的PBMCS，采用不同方法提高病毒分离成功比率，比如：剔除PBMCS中CD8。在分离当中，病毒自身因素会起到极大作用，比如：细胞嗜性、感染力度。 研究艾滋病当中，核心基础技术就是HIV分离培养[13-14]。研究HIV生物学表型、筛选药物、表型抗药性、中和抗体亲合特性等发现，分离培养有助于确诊HIV感染。对影响分离培养的因素进行研究发现，决定能否成功分离核心就是靶细胞状况，靶细胞的活化状况、灵敏度都会影响病毒分离的效率[15]。挑选完全活化、新鲜的正常人PBMC，有助于提高病毒分离比率。感染者机体包含的病毒载量大小，很大程度上会对能否顺利分离病毒有很大影响。此外，病毒分离还会受到共培养中细胞体积和浓度的影响。（2）HIV p24抗原检测：人体感染HIV后，最先被检测出的是HIV病毒RNA，接着才是p24抗原，最后检测出的是HIV抗体。一般处在窗口期与HIV-1抗体不确定阶段应用p24抗原检测，此检测可以评估病情变化与治疗效果，还可以判定婴儿有无早期母婴传播的情况[16]。HIV处在急性感染阶段，p24抗原就会最早出现，可以间接体现病毒复制状况。HIV感染被确诊后，需要对每位感染者的临床与实验室指标进行评定，从而明确HIV感染时期。临床采用ELISA双抗体夹心法检验，此方法的灵敏度不高，只能作为诊断的备选辅助手段，需要对感染者进行随访，并且再次检验确定RNA[17]。目前临床运用以下检验手段大大提升检测出p24蛋白的机率：超敏感酶免疫测定法（UEI）、免疫复合物裂解检测法（ICD）、线性免疫酶测定（LIA）等[18]。（3）核酸检验（NAT）：目前HIV最敏感检验方法就是核酸检验，其是依托聚合酶链反应（PCR），对RNA拷贝数进行检测，评定HIV病情进展与变化。拷贝数越高说明病情进展速度更快。但病毒载量检测不用作诊断工具，因为存在假阳性或假阴性。病毒基因组的定性检测可作为感染的标志。但它可以在特殊情况下补充或替代抗体检测来诊断HIV感染，比如：HIV感染母亲产下的新生儿，由于来自母体的抗体，在18个月龄前都有可能HIV抗体阳性。对于暴露的婴儿，至少2次核酸检测结果阴性，才能排除HIV感染。

3 无创性抗体检验

传统检验方法主要是检验机体的血液或血清，而这些检验方式有着复杂的检验流程，给受检人员带去很大痛苦。近些年来，医疗科技的快速发展，检验HIV抗体的内容得到扩大，由过去仅检查血液或血清，发展到提取受检人员的尿液或唾液，以诊断疾病。此种检验方法不会给受检人员带去创伤，极大压缩受检时间，尽管此方法的检验效果与传统检验方法没有多大区别，然而很大程度上，缓解患者痛苦，此方法成为检验艾滋病技术的创新。

4 抗体亲和力检验

抗体亲和力检验可以有效区分新近感染与过往感染，有利于流行病学调查。其工作原理就是与过往感染患者相比，新近感染者HIV抗体滴度、亲和力都偏低，在适当处理样本后，检验抗体亲和力、滴度，最终鉴别为新近感染或是过往感染[19-20]。此项技术是借助HIV抗原抗体复合物抵抗分离试剂的强度鉴别新近感染与过往感染，一般选择ELISA试剂进行检验。

5 小结

对于HIV病毒，需要给予有效检测，并及时采取干预和治疗措施，从而减缓其进展为艾滋病的进程，降低其危害程度。筛查艾滋病主要手段为HIV抗体检查，而实施筛查的实验室质量会直接影响到筛查结果。在实际检测过程中，应当不断完善有关制度，同时努力提升操作人员的检测专业技能，尽量防止有假阳性或假阴性检测结果出现。所以，临床需要充分掌握检验技术，从根本上预防与控制艾滋病。在提高有关操作人员的专业技能的前提下，人民群众还需要有主动测意识，二者有机结合，方可尽早确定HIV感染，并及时进行有效干预，延缓进展为艾滋病的进程，提高HIV感染者的生活质量。