HBV相关肝细胞癌的发生机制

颜永聪， 温 凯， 毛 凯， 肖治宇， 王 捷

中山大学孙逸仙纪念医院 肝胆外科， 广州 510120

原发性肝癌是最常见的致死性肿瘤之一，在常见的肿瘤类型中位列第六，死亡率排名第二[1]。国际癌症研究机构发布的《GLOBOCAN2018》报告称，每年约有841 000例肝癌新发病例和782 000例肝癌死亡病例[2]。肝细胞癌(HCC，以下简称肝癌)占原发性肝癌的70%～90%[3]。我国肝癌的发病率和死亡率在肿瘤中分别位居第四位和第三位[4-5]，严重威胁我国人民群众的生命健康。目前广泛认为肝癌的发生发展与多种危险因素密切相关，包括肝炎病毒感染、黄曲霉素、酒精滥用和肝脏自身代谢的异常等[6]。HBV感染是肝癌的主要危险因素，特别是在东亚和撒哈拉以南非洲地区，其危险性明显高于HCV感染、黄曲霉毒素污染的食品、大量饮酒、肥胖、吸烟和2型糖尿病[3]。在全球范围内，约有20亿人感染HBV，超过3.5亿人已成为慢性携带者[7]。尽管我国推广针对HBV的免疫规划，病毒性肝炎的新发病例数量在显著下降，但是慢性乙型肝炎仍影响着将近9000万人，是肝癌的主要病因，并且与肝癌的恶性进展、术后复发转移密切相关[8]。鉴于HBV感染引发的肝癌在所有肝癌病例中占比大，而且HBV参与肝癌的发生发展有其特殊的病理过程，相应的诊疗策略存在不同，所以HBV感染引发的肝癌有别于其他病因导致的肝癌，可以看作是肝脏的一种特殊的肿瘤，被称为HBV相关肝癌(HBV-HCC)。

HBV-HCC发病机制错综复杂[9]。本文在近年来相关文献的基础上，归纳总结HBV-HCC发生发展过程中的重要因素，包括HBV X蛋白(HBx)、免疫失衡以及病毒DNA整合等，同时结合本课题组的研究方向及成果，着重叙述HBx与细胞增殖、侵袭、转移、血管生成和凋亡的关系及其在HBV-HCC中的作用及机制，以期对HBV-HCC的防治工作带来新的思考。

1 HBV基因组结构和HBV-HCC的发生发展机制

HBV属于嗜肝病毒科，是一种部分双链环状DNA病毒。它的基因组包含四个重叠的开放阅读框，编码四种蛋白质，分别为pre-S/S(病毒表面蛋白)、C(病毒核心蛋白)、P(病毒聚合酶)和X (HBx蛋白)[10-11]。

HBV通常是通过HBx、免疫失衡以及病毒DNA整合入宿主基因组从而参与肝癌的发生发展。(1)HBx是一种由HBV编码的癌蛋白，研究[12-13]表明HBx可以作为癌基因或辅助因子，通过改变细胞的正常生理机制促进肝癌的发生发展；(2) HBV感染宿主后由免疫系统激活诱导T淋巴细胞攻击被HBV感染的肝细胞，肝细胞坏死后引起炎症，通过激活成纤维细胞导致肝纤维化进而导致肝硬化。此外由HBV感染导致的免疫反应可引发氧化应激反应并产生活性氧(ROS)，对DNA造成氧化损伤，DNA损伤的累积会进一步导致肝癌的进展[14]；(3)在85%～90%的HBV-HCC病例中，HBV基因组会整合到宿主基因组中，经过整合的基因还有进一步发生突变的可能，而这些会导致宿主基因组的不稳定以及各种细胞内信号传导途径的紊乱，进而促进肝癌的进展[15-16]。

2 HBx与HBV-HCC

HBx由HBV基因组的第四个开放阅读框编码，由145～154个氨基酸构成，是一种分子量为17 kD的多功能蛋白质，主要存在于HBV阳性肝细胞的细胞核中，细胞质中也有一定的累积，在HBV-HCC患者的肿瘤中经常被检测到，目前研究认为HBx是HBV感染致癌的重要因素，虽然不能结合于宿主细胞DNA序列上，但可通过与多种转录因子作用、反式转录激活、蛋白相互作用、改变DNA甲基化状态、翻译后修饰等多种形式影响细胞周期和细胞转化等关键信号转导通路，最终促进肝癌的发生与发展[17-18]。在这里，作者将结合近年来现有的研究，从以下不同角度阐明HBx在肝癌发生发展中的作用和相关机制。

2.1 HBx与细胞增殖 HBx可通过调控非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)促进肝癌细胞增殖。ncRNA主要包括长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和microRNA(miRNA)。尽管ncRNA不能编码蛋白质，但是越来越多的证据表明它们在细胞增殖、细胞周期控制、抗凋亡、上皮-间质转化、肿瘤浸润和转移中具有多种重要的生物学功能。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的ncRNA，其通过基因调控在遗传、转录或转录后水平上参与多种人类疾病的发生发展。最近的研究表明，HBx通过调控lncRNA促进肝癌细胞增殖在癌变过程中起关键作用。本团队报道了一种同时受HBx和SMYD3调控的新型lncRNA，并将其命名为lncIHS(HBx芯片与SMYD3芯片之间的lncRNA交集)，发现lncIHS在细胞质和细胞核中均有分布，主要位于细胞核中。lncIHS可能通过激活ERK和AKT信号传导及其下游分子(例如c-Myc，Cyclin D1和EMT相关基因)进而促进肝癌细胞迁移，侵袭和增殖；与癌旁组织相比，肝癌组织中lncIHS表达显着增加(P<0.01)；肝癌中lncIHS的高表达与HBV感染(P=0.002)、肿瘤较大(P=0.018)、门静脉侵犯(P=0.003)和TNM高分期 (P=0.002)相关。此外，具有高lncIHS表达的肝癌患者的总体生存期和无病生存期较短(P值均<0.01)；所以lncIHS可能是肝癌预后的候选生物标志物和潜在的治疗靶点[19]。在Yu等[20]的研究中发现lncRNA-6195通过抑制ENO1的酶活性抑制肝癌的生长，而在HBV-HCC中HBx通过下调lncRNA-6195的表达促进肝癌的进展。

miRNA是一种21～23个核苷酸的RNA分子，可以调节靶mRNA的稳定性或翻译效率。miRNA在肿瘤生物学的几乎所有方面都具有作用，例如增殖、凋亡、侵袭/转移和血管生成等。HBx可通过调控miRNA促进肝癌细胞增殖。在本团队早期的研究中，发现HBx在体外改变了肝癌细胞中miRNA表达谱，包括对miRNA-16家族的抑制。此外HBx介导的HepG2细胞中miRNA-15a/16的下调是通过c-Myc介导的，而体外表达的miRNA-15a/16通过诱导细胞周期阻滞和凋亡抑制HepG2-hbx细胞的增殖、克隆原性和不依赖于贴壁的生长[21]。此外，其他团队的多项研究[22-33]表明，HBx通过下调miRNA-18b、miRNA-137、miRNA-548p、miRNA-1236、miRNA-329、miRNA-124以及上调miRNA-135b、miRNA-539、miRNA-3928v、miRNA-5188、miRNA-155、miRNA-520e和miRNA-181b促进肝癌细胞增殖。

2.2 HBx与细胞的侵袭和转移 HBx通过多种机制促进肝癌的侵袭和转移。比如，Liu等[34]的研究表明HBx刺激NF-κB信号传导并增加血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶的表达，后者进而促进肝癌细胞的侵袭和转移。Han等[35]研究发现HBx与过氧化物酶体的特定分布可能通过增加细胞ROS水平从而增加肝癌细胞的侵袭能力。除此之外， lncRNA和miRNA在HBx促进肝癌细胞侵袭转移中同样发挥着重要作用。本团队的研究[36]发现lncRNA WEE2-AS1在肝癌组织中过表达，尤其是在HBV阳性肝癌组织中明显上调，Western Blot分析进一步证实WEE2-AS1可以上调FERMT3并激活PI3K/AKT/GSK3b信号通路，进而促进肝癌细胞的侵袭与转移。另外还发现了一个新的lncRNA LINC01352，它在HBV/HBx阳性肝癌组织和细胞中显著下调，作为肿瘤抑制基因参与HBx诱导的HBV-HCC进展，进一步的实验发现HBx/ERα复合物通过调控LINC01352-miRNA-135b-APC轴参与肝癌进展的过程[27]。在Liang等[37]的研究中发现，肝癌细胞中lncRNA-SOX2OT的上调可能导致肝癌微环境中PKM2含量升高，从而激活糖酵解途径，最终促进肿瘤的发生和转移，而miRNA-122-5p的表达可以抑制lncRNA-SOX2OT的表达。Xie等[38]的研究表明，miRNA-6875-3p表达升高，并可通过BTG2/FAK/Akt途径促进肝癌的增殖、侵袭和转移。Zhao等[39]研究发现，miRNA-26a通过抑制PTEN促进肝癌的侵袭/转移，并通过抑制肝癌中的EZH2抑制细胞增殖。

2.3 HBx与血管形成 众所周知，肝癌是一种高度血管化的实体瘤，血管生成对于肝癌的生长和转移非常重要。实际上，血管生成是血管生长和成熟的驱动因子之间失衡的结果，包括VEGF-A、B、C、和D,成纤维细胞生长因子，血小板源生长因子，血管生成素，肝细胞生长因子，内皮素(CD105)和其他因子等。缺氧被认为是刺激肿瘤血管生成的强烈因素[40-41]。目前，大多数研究肝癌低氧介导机制的体外和体内肝癌模型关注低氧诱导因子蛋白的上调，其诱导促血管生成因子表达上调，后者可通过MAPK和PI3K/Akt/mTOR途径激活内皮细胞酪氨酸激酶和随后的细胞内信号传导，进而导致肝癌肿瘤血管生成[42]。据报道[43-44]，HBx可上调缺氧诱导因子-1α的稳定性和转录活性以及VEGF和血管生成素2的表达，从而促进血管生成。

2.4 HBx与细胞凋亡 HBx诱导的肝癌相关细胞凋亡可通过激活多个胞内信号通路包括p53通路、MAPK通路等实现的。转录调节因子p53是一种抑癌基因,其主要功能是监测DNA复制和细胞分裂，阻断细胞周期进程并诱导凋亡以维持基因组完整性，当细胞受到内源性或外源性刺激时，由抑癌基因p53及其下游靶基因包括p21CIP/WAF1、Bax、TGFα、EGFR组成的p53途径被激活，p21CIP/WAF1抑制可诱导pRb磷酸化的cyclin-CDK复合物，随后阻止E2F1的释放，导致细胞周期停滞在G1期，最终诱导细胞凋亡[45]。p53与HBx之间的相互作用已被广泛证实，在转录水平上，HBx可以抑制p53启动子活性，并显著下调HBx转染细胞中p53的mRNA水平；在蛋白质水平上，HBx可直接与p53相互作用并抑制p53功能，这可能对早期肝癌的发生至关重要。有研究[46-49]表明，HBx可抑制p53、TGFβ、Fas和TNF诱导的细胞凋亡，下调Wnt/catenin的表达；或通过p38/MAPK途径和SATB1蛋白激活HURP的表达，导致抗凋亡蛋白积聚，最终抑制肝癌细胞凋亡。

对于无法手术或已经远处转移的肝癌患者，索拉非尼是目前的一线治疗药物。然而在索拉非尼的临床应用中，出现了获得性耐药的现象，尤其是在HBV-HCC中，其耐药机制目前仍未清楚。本团队研究发现HBV感染可通过调控miRNA-193b及其下游靶蛋白Mcl-1促进肝癌细胞对于索拉非尼的耐药；过表达miRNA-193b能够促进索拉非尼介导的肝癌细胞凋亡，改善耐药现象[50]。另外作者首次提出HBx通过细胞内聚积，可以上调P-Raf和P-Erk的活性，激活MAPK通路，参与Bortezomib在HBV相关肝癌中的靶向耐药。进一步发现，PD98059可以拮抗HBx诱导的Bortezomib耐药，且两者联合应用在HBV-HCC中具有协同效应。Bortezomib作为第一个临床应用的蛋白酶体抑制剂，PD98059作为一种MEK抑制剂，与其他已批准上市或正处于临床试验中具有MAPK通路抑制效果的药物(如索拉非尼等)联用，在HBV-HCC中也可能发挥协同作用[51]。

2.5 HBx与代谢 近年来，有关代谢重组机制的研究为解释HBV-HCC的发生发展提供了新的视角。既往研究提示HBx可影响肝细胞脂质代谢。Kim等[52]首次报道了HBx过表达可通过激活固醇调节元件结合蛋白1和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)的转录水平，进而导致肝细胞脂肪变性。Na等[53]进一步揭示了HBx联合肝X受体促进肝细胞脂肪变性从而导致HBV-HCC发生的分子机制。最近研究[54]显示，HBx通过抑制miRNA-384使得促癌因子多效生长因子的表达上调，后者通过增加固醇调节元件结合蛋白-1c和脂肪酸合酶的合成引起肝脂质代谢异常，进而促进肝癌发生。HBx还可通过激活P2X-Akt途径导致肝异常脂质代谢异常，而降脂药阿伐他汀可抑制这一现象，并抑制肝癌细胞的增殖和侵袭能力[55]。在糖代谢方面，HBx可通过激活转录因子Nrf2,上调葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达水平，改变肝的正常糖代谢过程[56]。最新研究[57]发现，HBx通过BNIP3L介导的线粒体自噬，重组糖酵解代谢过程，导致肝癌细胞干性增加。 除此之外，HBx还可通过lncRNA H19/miRNA-675/PPARα轴重组肝细胞损伤及能量代谢过程[58]。 总的来说，HBx通过代谢信号通路的调节对肝细胞代谢过程进行重组，为HBV复制提供所需要的脂质、蛋白质、核苷酸和能量，进而促进了HBV相关的癌变进程。

3 免疫失衡与HBV-HCC

肝脏，实际上可被视为一个“一线免疫器官”，含有大量先天性和适应性免疫细胞，包括巨噬细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤性T淋巴细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞等，它们可检测、捕获和清除病原体、招募白细胞、呈递抗原并启动免疫应答反应，在宿主防御、维持免疫稳态中起着重要的作用[59]。免疫激活和免疫耐受之间的平衡至关重要，在人类慢性HBV感染过程中，肝损伤并不是由病毒直接引起的，而是由试图清除病毒的免疫反应所致，肝脏免疫状态从免疫耐受逐渐转变为免疫激活、失活、再激活，最终发生免疫衰竭，这可能是导致肝癌发生的免疫致病因素[60]。

数据显示，90%的HCC发生与肝损伤及炎症有关，因此HBV-HCC被普遍认为是炎症相关肿瘤，这种炎症实际上是由肝脏中长期存在的HBV持续招募免疫细胞而建立起来的慢性低水平炎症状态。HBV感染使得单核细胞及原髓细胞在肝组织中浸润活化，产生IL-6、TNFα、IL-1β、IL-18等促炎因子[61-66]，并通过NF-κB、STAT3、Wnt/β-catenin等多个信号通路，影响ROS的产生，干扰正常的免疫调节机制，介导免疫逃逸形成[67-70]；同时还产生抗炎反应(TGFβ、IL-10等)以抑制过度的炎症损伤，干扰正常的损伤修复过程，最终导致肝纤维化、肝硬化及HCC的发生[71]。

4 HBV DNA整合与HBV-HCC

HBV DNA整合入宿主基因组被认为是导致HBV-HCC发生发展的重要因素，然而其具体机制尚未完全明了[72]。一项针对1115个HBV整合位点的研究[73]发现，HBV容易整合在外显子、内含子、启动子以及基因密集区域，进一步的功能注释分析显示，与邻近非肿瘤组织相比，HCC肿瘤组织中的整合靶向宿主基因在与细胞死亡负调控、转录调控、发育分化及肿瘤相关通路相关的功能方面显著富集。Zhao等[74]采集426例HCC患者的肿瘤组织及癌旁组织，借助高通量病毒整合检测和RNA测序分析识别出4225个HBV整合事件，发现HBV容易整合到罕见的脆弱位点和功能基因组区域，HBV在肿瘤组织和癌旁组织的优先整合位点不一样，HBV插入位点在肿瘤端粒附近显著富集，具有男性及肝硬化依赖模式，最终驱动致癌转化。而新近一则研究[75]发现，70%HBsAg阴性的HCC患者存在隐匿性HBV感染，其中69%患者的HBV DNA与肝细胞DNA融合，而这些患者中90%没有肝硬化，此外，HBV DNA整合主要发生在肝癌相关基因附近，如端粒酶逆转录酶基因、赖氨酸甲基转移酶2B基因和细胞周期蛋白A2基因，提示HBV基因整合可能是导致血清学阴性且无肝硬化背景的患者发生肝癌的重要机制，因此对于HBV感染消退、HBsAg缺失的患者，临床上建议仍应检测其肝组织中的HBV DNA，以确定是否存在发生HCC的风险。

5 结论

HBV-HCC的发生发展是一个多分子参与、多信号通路交织作用和多步骤的过程，涉及HBV蛋白HBx、免疫失衡以及病毒DNA整合入宿主基因组等机制，其中，重点阐述了HBx在HBV-HCC发生发展中的各种恶性生物学功能，包括调节细胞增殖、侵袭、转移、血管生成和凋亡以及相关分子机制等。未来方向应进一步深化探索HBV-HCC发生发展的具体分子事件及作用机制，为发现新型治疗靶点提供新的思路及坚实的理论依据。