长链非编码RNA对肝纤维化的调控作用

卢能源， 钟芳菲， 邓青梅， 杨研琪， 郑 洋， 赵铁建,b， 梁天坚

广西中医药大学 a. 赛恩斯新医药学院； b. 基础医学院生理教研室， 南宁 530021

肝纤维化是机体对于胆汁淤积、病毒性肝炎、慢性酒精中毒等病因所致持久肝损伤而反馈出的一种自我修复反应。其本质是以胶原蛋白为主要成分的细胞外基质(ECM)的降解减少，而合成相对增加，两者失衡，从而导致过多的ECM积聚于肝脏内，引发肝纤维化[1]。ECM主要由持续处于活化状态的肝星状细胞(HSC)分泌[2]。肝纤维化发生时，众多的致纤维化因素会不断地刺激HSC，使其激活并转化为成纤维细胞，并大量分泌ECM、生长因子以及趋化转化因子，且还使α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的水平显著增多以作为HSC被激活的标志[3]。近年来大量研究[4]显示，长链非编码RNA(lncRNA)可作为竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)与微RNA( microRNA，miRNA)结合，进而调控下游的Wnt、Notch等多条信号通路来影响HSC的活化[5]，间接地调控肝纤维化的发展进程。上述研究表明lncRNA有望作为标志物和治疗靶标被用来诊断、治疗肝纤维化。本文就lncRNA通过充当ceRNA而对肝纤维化发挥调控作用的最新研究进展作一综述。

1 LncRNA概述

1.1 lncRNA的定义及特点 lncRNA是一种转录本长度超过200 nt的RNA分子，多数于细胞核、细胞浆内被发现，约占lncRNA的80%。据报道[6]，绝大多数的lncRNA都来源于RNA聚合酶Ⅱ的转录，部分经过剪接后具有5′帽子结构和3′端多聚腺嘌呤尾巴，结构与编码蛋白质的信使RNA(mRNA)类似。与mRNA不同的是，lncRNA具有较低的保守性和时空表达特异性。由于lncRNA没有开放的阅读框，所以其无法编码蛋白质，或者个别虽有开放阅读框，但阅读框很小，仅能编码100个氨基酸以内的小多肽[7]，如lncRNA LINC00961[8]。其实类似于这种包含小的开放阅读框且能编码功能性肽的暂时被假定为lncRNA的序列，可能归类于编码 RNA更合适[9]。由此看来，lncRNA的编码能力远比之前想象的要繁琐复杂，继续深入研究以完善对其编码能力这方面的认知显得十分重要。

1.2 lncRNA的分类 由于目前对lncRNA来源、功能等多方面的探索尚未完全，所以目前并无统一的lncRNA分类依据。Wang等[10]将lncRNA的众多功能提炼为四种分子机制，即按照lncRNA的功能将其分为四种类型的分子，分别为信号型分子、诱饵型分子、指南型分子以及骨架型分子。Dhanoa等[11]指出，可根据编码基因与lncRNA的相对位置和方向，将其初步分为：正义链lncRNA、反义链lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA以及基因间长链非编RNA(long intergenic non-coding RNA，lincRNA)。Sanbonmatsu等[12]指出，未来可能会根据lncRNA的二级结构将其直接分为三种类型，分别是具有子域和复杂结构图案的高度结构化的RNA分子、具有多个茎环结构而缺乏子域和复杂图案的结构松散的RNA分子、缺乏二级结构而无子域无图案的RNA分子。

1.3 lncRNA的生物学功能 lncRNA参与多种病理进程和生物学功能，如恶性肿瘤、细胞的增殖、分化以及凋亡[13]。lncRNA可以通过靶向转录因子、直接甲基化复合物、启动染色质重塑和阻断附近基因的转录等形式来影响细胞活性及生物途径[14-15]。在肝纤维化的发展阶段，一些lncRNA通过充当ceRNA与miRNA结合，发挥正性或负性调节肝纤维化的作用。

2 肝纤维化相关的lncRNA

据文献[16]报道，一些热门的lncRNAs，包括母系表达基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、生长停滞特异转录因子5 (growth arrest-special transcript 5,GAS5)[17]、lincRNA-p21[18]，均在肝纤维化小鼠模型或肝纤维化患者肝组织或TGFβ1诱导的LX-2人HSC中表达减少，具有明确的抗肝纤维化作用。与此相反，肺腺癌相关转录因子1(metastasis -associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)[19]、转化生长因子β激活的lncRNA(lncRNA-activated by transforming growth factor beta,lncRNA-ATB)[20]、浆细胞瘤变型异位因子1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)[21]、同源盒转录反义RNA( homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR)[22]、lncRNA-H19[23]和小核RNA宿主基因7(small nuclear RNA host gene 7, SNHG7)[24]于肝纤维化小鼠模型或肝纤维化患者肝组织或TGFβ1诱导的LX-2人HSC中表达增加，具有促肝纤维化作用。lncRNA与肝纤维化的相关性主要表现在其促肝纤维化或抗肝纤维化方面[25]。

2.1 具有抗肝纤维化作用的lncRNA

MEG3、GAS5以及lincRNA-p21皆已被证明具有抗肝纤维化作用。这些lncRNA具有相似的特性，如都可以充当ceRNA与相关的miRNA结合，调控下游的信号转导途径，抑制HSC的增殖活化，减轻肝纤维化程度。由此看来，上调它们的表达水平有望用于逆转肝纤维化。

2.1.1 母系表达基因3(MEG3) MEG3定位于人14号染色体q32.3的DLK-DIO3印迹区域，长度约为1.6 kb，是一种母系表达的长链非编码基因。He等[16]研究指出，MEG3可通过p53介导的线粒体凋亡途径来促使HSC LX-2发生凋亡。此外，MEG3可通过与SMO蛋白相互作用来抑制Hh介导的内皮-间质转化(EMT)过程；亦可通过海绵化miRNA-212来抑制EMT过程，进而阻止HSC的激活[26]。

2.1.2 生长停滞特异转录因子5(GAS5) lncRNA-GAS5定位于人染色体 1q25，长度约4087 bp，含有5′-TOP序列。GAS5可作为抑癌基因来抑制肿瘤的进一步发展，如lncRNA-GAS5表达下调于膀胱癌[27]、肾细胞癌[28]等肿瘤中；其亦可作为致癌基因来促进肿瘤的发生发展，如GAS5表达上调于食管癌[29]等肿瘤中。Yu等[17]通过慢病毒载体调控GAS5过度表达，发现GAS5可作为ceRNA与miRNA-222竞争性结合，使miRNA-222表达减少，细胞周期抑制剂p27的蛋白水平增加，进而体外抑制HSC的增殖、激活。此外，Dong等[30]研究指出，lncRNA-GAS5还可通过充当miRNA-23a的ceRNA并与之结合，抑制miRNA-23a对磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)的降解作用，阻碍PTEN下游磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，蛋白激酶B(Akt)，雷帕霉素(mTOR)磷酸化，下调蜗牛哺乳动物靶标(SNAIL)的表达水平，从而抑制PTEN/PI3K/Akt/mTOR/SNAIL途径，减少α-SMA 和Ⅰ型胶原α1(collagen type I alpha 1，COL1α1)的合成，抑制HSC活化，阻止肝纤维化。提示GAS5/miRNA-222/p27和GAS5/miRNA-23a/PTEN/PI3K/Akt/mTOR/SNAIL途径可为肝纤维化的逆转提供治疗靶点。

2.1.3 基因间长链非编RNA-p21(lincRNA-p21) lincRNA-p21最早是在小鼠成纤维细胞内被鉴别出来的[31]，其定位在Cdkn1a(p21)基因上游约15 kb 处，属17号染色体，长度约为3 kb。Zheng等[18]研究发现，上调lincRNA-p21的表达水平能够抑制体外HSC活化和减轻CCl4诱导小鼠的肝纤维化程度。而该过程的分子机制，可能为lincRNA-p21充当ceRNA直接竞争性结合miRNA-181b，使miRNA-181b表达减弱，编码磷酸酯酶的基因PTEN表达增加，从而使PI3K/Akt 信号通路的激活受抑制，HSC的活化受抑制[32]。提示lincRNA-p21为HSC的活化抑制因子，有望成为逆转肝纤维化的分子靶点。

2.2 具有促肝纤维化作用的lncRNA

MALAT1、lncRNA-ATB、PVT1、HOTAIR、lncRNA-H19和SNHG7皆具有促肝纤维化作用。而这些lncRNA亦具有相似的特性，如它们都可以充当ceRNA与相关的miRNA结合，调控下游的信号转导途径，促进HSC的增殖活化，促进肝纤维化。因此，下调它们在肝纤维化患者体内的表达水平，可能是阻止肝纤维化进一步发展的良好举措。

2.2.1 肺腺癌相关转录因子1(MALAT1) MALAT1是一种核内保守的基因间lncRNA，于细胞核中富集，位于人染色体11q13区域，其转录本长度约为8000 nt。Yu等[19]研究证明，MALAT1可作为ceRNA与miR-101b竞争性结合，上调miRNA-101b靶标RAC1的蛋白表达水平，促进HSC活化。Wu等[33]研究发现，MALAT1可与组蛋白去乙酰化酶(SIRT1)结合，抑制SIRT1的表达，从而促进LX-2人HSC活化以及肌成纤维细胞标志物α-SMA和COL1α1的合成，促进肝纤维化。因此，靶向MALAT1/miRNA-101b/RAC1途径和调控SIRT1过度表达可能会成为治疗肝纤维化的新方案。

2.2.2 TGFβ激活的lncRNA(lncRNA-ATB) lncRNA-ATB是TGFβ信号通路的关键调节因子，由TGFβ活化，定位于人第14号染色体，长度约为80 kb。据报道[20]，lncRNA-ATB可作为ceRNA竞争性结合miRNA-425-5p，促进HSC的激活以及增加胶原的合成量，进而加剧肝纤维化。此外，lncRNA-ATB还可通过与miRNA-200a竞争性结合，降低其表达，同时增加β-catenin的表达，从而促进HSC的活化和增加Ⅰ型胶原的合成，加剧肝纤维化[34]。因此，将lncRNA-ATB视为一个新的促肝纤维化因子，并对其进行敲低甚至敲除，以减少HSC的活化数量和抑制胶原蛋白的合成，不失为一个临床治疗肝纤维化的良好方案。

2.2.3 浆细胞瘤变型异位因子1(PVT1) PVT1的转录本长度约为1957 nt，是一种基因间lncRNA，由定位染色体8q24区上的PVT1基因编码。PVT1是一个十分重要的癌症lncRNA,其致癌作用已在多种癌组织中被证实，如肝细胞癌[35]、胆囊癌[36]和卵巢癌[37]。Zheng等[21]研究表明，操控PVT1基因沉默可在一定程度上抑制HSC的活化，其可能是由于PVT1基因的沉默使EMT过程受阻所致。而沉默PVT1基因，还会使Hh信号通路负向调节因子Patched1(PTCH1)的表达增强[38]，使Hh信号通路失活， HSC的增殖受抑制[21]。此外，PVT1可作为ceRNA与miRNA-152结合，减弱miRNA-152对小干扰PVT1的抑制，增强小干扰PVT1对Hh信号通路负调控因子PTCH1的脱甲基诱导，并表观遗传地下调PTCH1的表达水平，激活肝纤维化中的Hh信号传导通路，促进HSC的激活和EMT过程，加剧肝纤维化[21]。

2.2.4 同源盒转录反义RNA(HOTAIR) HOTAIR是由HOXC基因片段转录而来的反义基因间lncRNA，定位于人12号染色体q13.13，转录本长度约为2158 bp，具有致癌作用[39-40]。Bian等[22]研究表明，上调HSC中HOTAIR的表达水平，可在一定程度上沉默MEG3，促进HSC增殖活化，促进肝纤维化；而沉默HOTAIR则作用相反。探究其分子机制，一方面可能为HOTAIR增加组蛋白修饰酶复合物PRC2在MEG3启动子区域中的占有率，增强PRC2对组蛋白H3K27的三甲基化诱导，从而使MEG3低表达，促使HSC活化[22]。另一方面可能为HOTAIR充当ceRNA与miRNA-148b竞争性结合，削弱miRNA-148b对其靶标DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)表达的抑制作用，促进DNMT1的表达，从而增强HSC中DNMT1对MEG3、p53表达的抑制作用，促进HSC活化，增进肝纤维化进程[16]。提示HOTAIR参与了MEG3的表观遗传调控，有望作为治疗肝纤维化的潜在靶点。

2.2.5 长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19) lncRNA-H19来源于人染色体11P15.5区域上的H19印迹基因，转录本长度约为2.3 kb，可调节DNA甲基化、染色质重构，也可作为miRNA前体对细胞内的组蛋白进行修饰，继而多水平调控机体的功能。最近，有研究[23]显示， lncRNA-H19可通过充当ceRNA直接竞争性结合miRNA-148a，释放miRNA-148a的靶标泛素特异性蛋白酶4，使转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor-β receptor typeⅠ,TGFβRⅠ)泛素化水平上调，促进TGFβRI与 TGFβ1结合，进而激活HSC并促进肝细胞EMT的发生，促进肝纤维化。此外，在胆道闭锁患者的纤维化肝组织中，lncRNA-H19的表达水平会随着肝纤维化程度的加深而升高[41-42]。并且，lncRNA-H19可通过控制鞘氨醇1-磷酸受体2/鞘氨醇激酶2以及miRNA let-7/高迁移率蛋白A2途径影响胆道闭锁患者的胆管细胞增殖和肝损伤[41-42]。因此，lncRNA-H19有望成为肝纤维化的治疗靶标和诊断标志物。

2.2.6 小核RNA宿主基因7(SNHG7) SNHG7是一种新发现的lncRNA，长度约为2157 nt，定位于9号染色体。据报道，SNHG7是一种典型的致癌基因，能促进多种癌细胞的增殖、侵袭和迁移，如肺癌[43]、膀胱癌[44]和前列腺癌[45]等。Yu等[24]通过体内和体外实验证明， SNHG7可充当ceRNA竞争性结合miRNA-378a-3p，减弱其对其靶标紊乱片段极性蛋白2的抑制作用，加快Wnt信号通路的激活速度，并促进HSC活化和肝纤维化。提示lncRNA-SNHG7可作为一种生物标志物来诊断和判断肝纤维化预后。

3 总结与展望

伴随着高通量测序技术的出现和进步，大量的lncRNA被不断地鉴定出来。虽然lncRNA无法编码蛋白质，但其可在转录前、转录及转录后等层面参与调控细胞的活性和基因的表达，从而于各方面不同程度地参与肝纤维化、肝癌等疾病的发生发展。近年来，通过研究lncRNA在调控肝纤维化的信号通路上的异常表达，发现众多的lncRNA可通过充当ceRNA与 mRNA竞争性结合，直接调控mRNA靶基因等因子来调节HSC的活化程度和衰老速度，进而调控肝纤维化的发展进程。不难发现，这是一张巨大且相互交错的基因网，为肝纤维化的病理进程研究提供了广阔的可探索空间。虽然到目前为止，学者们对lncRNA生物功能及分子机制的研究，特别是其在肝纤维化等疾病发病机制上的研究尚不完全。相信随着科研技术的不断进步，将会逐渐发现lncRNA在肝纤维化中更多的调控机制和功能，为肝纤维化的程度鉴别，临床治疗及预后判断等提供更新更坚实的理论基础。

作者贡献声明：卢能源负责文献检索，文章思路设计，论文撰写与修订；钟芳菲、邓青梅、杨妍琪负责文献检索与资料分析；郑洋、赵铁建、梁天坚负责指导撰写文章及最后定稿。