人弓形虫病诊断方法的研究进展

刘文彩，黄 鹏

(1.南昌大学a.第一临床医学院2018级；b.公共卫生学院循证医学中心；2.江西省预防医学重点实验室，南昌 330006)

弓形虫病正感染着全球超过30%的人口，逐渐成为一种全球性健康危害[1]，在我国弓形虫感染率也超过10%[2]。临床上该病主要引起中枢神经系统损害(如脑炎、癫痫、精神异常)以及孕妇的流产、早产、畸胎或死胎，其中畸胎发生率最高，且会传染给胎儿[3]。本文拟对人弓形虫病诊断方法的发展进行综述，以期为人弓形虫病的诊断提供更多选择。

1 传统诊断方法

1.1 病原学诊断

病原学检查主要通过对患者组织、体液或用其接种培养出的生物样本进行镜检，以观察到寄生虫作为诊断依据。此类检查简单方便，具有确诊意义，但阳性率不高，易漏检。

1.1.1 涂片染色法

取急性期患者的各种体液如脑脊液、胸腔积液、腹水、羊水、痰液、骨髓或血液等，进行离心后取沉淀物制作涂片，或采用组织切片经吉姆萨(Giemsa)染液染色后直接镜检检测弓形虫滋养体[4]。或用这些体液和组织制片使用间接荧光染色法检测：置于载玻片上干燥5～15 min，酒精固定15 min，加30 μL单抗，37 ℃温育30 min，PBS洗涤干燥，添加二抗，37 ℃温育30 min、干燥后镜检[5]。

1.1.2 动物接种或细胞培养法

取患者的待检样本接种于小鼠腹腔，培养1周后剖杀取腹腔液镜检，或将样本接种于离体培养的细胞中培养9 h，然后进行镜检[6]。其优点是比直接涂片染色观察检出率更高，但其耗时较长，同时可能具有扩散病原体的风险[5]。

1.2 血清学诊断

血清学诊断方法是临床实验室诊断弓形虫病的首选和最常用的诊断方法。在临床中，对于孕妇妊娠期弓形虫病的检测，血清学方法具有重要意义[7-8]。通过对IgG亲和力的测定可以更好地估计被感染的时间并确定妊娠期间是否发生原发性弓形虫的感染[7]。这些方法是基于宿主弓形虫特异性免疫球蛋白对弓形虫表面抗原的识别。不同的血清学诊断方法常常检测不同的抗体。感染弓形虫后，抗体(Ig)相继产生，抗体产生的动力学可能有助于确定感染的阶段。感染后1周内首次产生IgA和IgM，1个月内滴度达到稳定，1～6个月后下降。在某些个体中，IgM可在急性感染后很长时间内被检测到，所以IgM阳性结果可能提示急性、近期或过去感染[9]。此外有一些方法可以进行辅助检测，如特异性IgA检测、IgG效价分析和IgG亲和度检测，以便更好地确定感染阶段。不过，特异性IgA不能作为急性感染的替代标志物。特异性IgG在感染开始后2～3个月内达到一个平台期，然后降低并保留持续终生的残留滴度。IgG阳性结果提示既往感染，但不能准确判断感染的时间。

1.2.1 染色试验(DT)

染色试验是根据Sabin和Feldman的微量滴定技术进行的经典血清学方法，具有良好的特异性、敏感性和可重复性[10]。其原理是活动弓形虫速殖子的细胞质在接触抗原抗体复合物时发生了改变，不能被甲蓝染成蓝色。当检测结果为阳性时免疫血清(含特异性抗体)60%以上胞外速殖子呈未染及新月形正常的形态；当检测结果为阴性时(不含特异性抗体)，细胞外50%以上及细胞内速殖子均表现为甲蓝染色的深蓝色，且呈圆形或卵圆形。在一项对妇女和绵羊、山羊中弓形虫病诊断方法的对比研究[11]中显示，DT法与ELISA IgG法、PCR法的检测结果均无显著差异(P>0.05)。但也有研究[12]显示，在52个低浓度IgG(2～10 U·mL-1)样本中用DT法检测，3次均出现假阴性结果，这表示DT法对低水平IgG结果的解释还存在着一定的不足。

1.2.2 间接血凝试验(IHA)

间接血凝试验法是将抗原(或抗体)包被在红细胞的表面，使其成为致敏的载体，之后与相应的抗体(或抗原)结合，从而使红细胞拉聚在一起，出现可见的凝集反应。该法有较好的特异性和敏感性，配合试剂盒使用操作简便，只需采取血液并离心得到血清样本，在低温条件下使用一定的稀释度对样本进行滴度检测即可。一项流行病学研究[13]使用IHA、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验分别对不同的山羊群血清样本进行测试，结果显示三者阳性和阴性结果一致指数均较高(97.7%)，此外，三者之间的相关性也很高。但也有研究[14]表明IHA要比改良凝集试验(MAT)的检测效果弱一些。

1.2.3 改良凝集试验(MAT)

MAT是利用制备的弓形虫整虫抗原可以识别不同动物的抗体扩大了可凝集的抗原抗体范围的改良法，在血清中抗体和弓形虫的速殖子表面上的抗原结合后才能够发生交联凝集反应，有较好特异性，现在市场上已经出现了商业化改良试剂盒，使用较简便。在埃及的一项对绵羊的血清样品进行弓形虫病血清学检测的比较研究中[15]，MAT法的灵敏度可达96%，特异性达到88.9%。在巴西的一项针对山羊的弓形虫病血清学比较研究中[16]，以间接免疫荧光法(IFA)为标准，ELISA和MAT也表现出相当的一致性(kappa=0.74和0.61)。CASARTELLI ALVES等[17]学者的一项评估不同实验室诊断方法的研究显示，MAT法的敏感性和特异性达到了76%和68%，是该项研究中效果最好的诊断方法。上述研究表明了MAT法具有较好的敏感性和特异性，与ELISA、IFA相比具有更短的耗时、更少的劳动力需求、更简单的设备与操作和可以在任何物种的血清上进行等优点[18]。但若在具有高度溶血或脂质的样本中，MAT的阳性率可能会偏高[19]。

1.2.4 间接免疫荧光试验(IFA)

IFA采用完整虫体为抗原，以荧光标记的第二抗体检测特异性抗体，当大多数固定的速殖子(>50%)在1:64和1:50稀释时对弓形虫有完全的外周荧光，血清样本即被认为是阳性的[20]。该检测方法可测同型及亚型抗体，在新生儿先天性弓形虫病感染的检测中用其检测IgM，对疾病早期诊断和判定具有较大意义。在SINGH等[21]的一项检测家养反刍动物弓形虫病抗体的研究中，基于重组SAG2抗原的ELISA法与IFA法相比，其检测灵敏度在81.25%至87.10%，而特异性处于85.71%至91.43%，二者检测结果显示出了较高的一致性；通过IFA法发现111例(28.38%)血清阴性和280例(71.61%)血清阳性，通过ELISA检测发现124例(33.70%)血清阴性，267例(68.28%)血清阳性，二者结果无显著差异(P>0.05)，并且因其较高的准确性及较为低廉的检测费用，IFA法与ELISA法在临床上应用于孕妇产前检测弓形虫病上具有积极的意义。在CASARTELLI ALVES等[17]的对多项实验室诊断方法检测弓形虫感染的对比研究中，IFA法的敏感性和特异性为80%和52%，虽略低于MAT但也显示出了较好的检测效果。但若在使用G蛋白非特异性结合抗体时，G蛋白与抗体的亲和性差异也可能导致检测结果产生偏差[19]。

1.2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA法可用在检测宿主的多种特异性抗体如IgG、IgM和IgA等，现已存在多种改良法广泛用于先天性和早期急性感染弓形虫病的诊断[6]。其基本操作方法是先将抗原或抗体结合到固相上，再加入特异性的抗体或抗原形成抗原-抗体结合物，然后使用酶标记的抗原或抗体去结合从而达到检测的目的[20]。在GHONEIM等[11]的一项研究中用ELISA(检测IgM和IgG)和DT染色法对绵羊弓形虫病进行检测，阳性率分别为98.4%和90.3%。在CASARTELLI ALVES等[17]的对多项实验室弓形虫诊断方法的对比研究中，ELASA法的敏感性和特异性分别为85%和56%，显示出了较好的检测效果。Singh和Sudan的两项基于重组SAG2抗原的ELISA法检测弓形虫病的研究中，SINGH等[21]用来自绵羊、山羊和牛的168个现场血清样品评估了重组蛋白的诊断潜力，并与IFA法进行了对比，结果显示recSAG2-ELISA的灵敏度为81.25%～87.10%，而特异性为85.71%～91.43%，具有较高的吻合性；SUDAN等[22]用258头牛血清样品评估了重组蛋白的诊断潜力，也与IFA法进行了相比，recSAG2-ELISA的敏感性为80.00%，特异性为88.57%(CI=95%)，2次试验之间基本吻合。在一项对孕妇弓形虫病感染的研究中[6]，研究者使用了ELISA和IFA(针对IgG和IgM抗体)分别对孕妇的感染进行了检测，结果通过IFA发现111例(28.38%)血清阴性和280例(71.61%)血清阳性，通过ELISA检测发现124例(33.70%)血清阴性，267例(68.28%)血清阳性，二者结果具有较好的一致性，且ELISA的效果优于IFA。因其优良的检测性能与不复杂的检测操作，当高度怀疑感染及孕早期感染时，重复该血清学检测和其他化验方法进行结果快速确认在临床上对患者的诊断具有重要意义[23]。以上研究表明，ELISA法对弓形虫抗体的检测具有较好的效果，但可能由于使用多物种结合物而被低估[19]。

2 分子诊断方法

目前血清学方法诊断仍存在一些无法解决的局限性，如无法确认先天性传播或免疫缺陷患者的胎儿和大脑中是否存在弓形虫。分子诊断技术的使用，可有效避免对子宫内胎儿采用侵入性的检测方法，近十年来已开发出不同的分子检测方法，包括传统PCR、巢式PCR(nested PCR)、实时PCR(real-time PCR)以及循环介导等温扩增技术(LAMP)等来检测生物样本中的弓形虫基因[24]。未来随着生物信息学与基因组学的进步，将会有越来越多的靶向基因被发现，这又将促进弓形虫分子诊断的进一步发展。

2.1 传统PCR

在传统PCR方法中，一个特定的基因组片段可以被扩增放大，从而产生数百万个目标DNA分子。BURG等[25]最早建立了弓形虫的PCR检测技术，扩增了弓形虫基因组的35个重复B1基因。之后，18S rRNA-基因、P30-基因、b1-基因、529-bp重复片段和AF146527等多个多拷贝靶向基因被用于不同生物样本中弓形虫的检测[26]。PCR技术已成功地使用脑组织、房水、玻璃体液和羊水、胎盘用于诊断先天性和眼部弓形虫病，此外，全血、尿、脑脊液、胸膜和腹腔液也已被有效地用于诊断免疫缺陷患者所患的弓形虫病。在埃及的一项对妇女弓形虫病的检测手段的对比研究中[11]，ELISA、DT和PCR的检测结果之间无显著差异(P>0.05)。在一项对野生鸟类的弓形虫感染的研究中[27]，使用IFA和PCR对216只动物进行了检测，阳性率分别为11.6%和8.8%。这显示了其与血清学诊断之间结果具有较好一致性。

2.2 巢式PCR

其可以用来增加DNA扩增的特异性以检测数量很少的病原体，并且可作为诊断不同弓形虫病类型的一种有价值的、准确的、特异的方法。此外，巢式PCR对河流、水井和海水中弓形虫卵囊的检测也具有较高的敏感性[28]。ALONSO等[29]的一项研究表明，巢式PCR是一种快速、灵敏、有效的检测HIV患者弓形虫病的分子诊断方法。

2.3 实时PCR

该方法是近年来发展起来的一种检测方法，它对临床样本中的病原体具有较高的特异性和诊断准确性，同时RT-PCR是检测病原体较敏感的分子检测方法，特别是在目标DNA浓度较低时。RT-PCR较传统PCR的主要优点在于不需要打开反应管，可以降低扩增子遭受环境污染的风险，减少假阳性结果，此外，RT-PCR检测与传统PCR相比还具有更快速、灵敏和可重复性的特点。WELLS等[30-31]的研究表明，RT-PCR方法具有较高敏感性，并且与其他分子生物学方法相比有较好一致性。

2.4 多重PCR

多重PCR可以联合使用多个引物集进行病原体的检测，可以实行巢式多重PCR检测和实时多重PCR检测。HALLU等[32]设计了一个多重PCR方案，该PCR包含靶向人β球蛋白基因的引物(可作为内部对照)和2个针对B1基因和5s基因的引物，结果显示该法灵敏度为83.3%，特异性为100%。RAHUMATULLAH等[33]也开发出一种针对B1基因和ITS-1区域的多重PCR，其在检测中敏感性可达97.5%～99.9%，效率达97%～99%，能检测到10 pg的弓形虫DNA，104个体液中的速殖子。上述研究表明了多重PCR在弓形虫检测的敏感性和特异性较单一PCR具有一定优势，也提示在基因位点的选择上仍存在较大发展空间。

2.5 循环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP是一种改良的PCR方法，具有灵敏度高、特异性强、高效、快速等优点。该方法利用具有链沉降活性的DNA聚合酶(Bst)和4～6个特异性引物，在恒温(60～65 ℃)条件下扩增DNA，能识别目标DNA中的6～8个不同区域[34]。LAMP与传统PCR相比，具有不需要特别复杂的设备，不需要长耗时，不需要提取DNA，对血液、血清和食品配料等PCR抑制剂的耐受性更强的优点[34]。在一项使用LAMP和巢式PCR检测白血病儿童弓形虫抗体的研究中[24]，在50份血清阳性样本(IgM+，IgG+)中，获得的阳性结果LAMP分别占92%和86%，巢式PCR分析分别占82%和68%，LAMP体现出了较高的准确率。同时在对10倍稀释的弓形虫DNA进行检测时，LAMP在与巢式PCR的对比中显示出了更高的灵敏度[26]。

3 诊断方法的联合使用

诊断方法的联合主要是血清学与分子技术的联合诊断。联合诊断可以提高检测灵敏度、特异性和检测效率，并且克服了现有手段的局限性，将两种手段进行优势互补以获得更理想的诊断效果。

ELISA-PCR联合诊断弓形虫病，既提高了检测范围，又提高了准确度，且在联合检测中可以缩短操作时间，比单一方法具有更好的分析性能。其操作为先用ELISA法对患者血清样本进行检测，再对抗体阳性的患者取血样进行DNA提取和扩增进行检测，进一步分析有抗体亲和性差异的结果[35]。一项对孕妇弓形虫病的早期诊断研究[35]，从143名孕妇中收集血清，并用ELISA法检测弓形虫的IgM、IgA和IgG的亲和力；从57个外周血和14个羊水样本中提取DNA进行PCR扩增。结果显示使用ELISA检测143名妇女中有57名血清反应阳性，其中9名女性的IgG抗体亲和力低，表明存在急性感染；3名妇女表现出中等亲和力。用PCR检测出了9名表现出低亲和力女性存在弓形虫DNA，而对于中等亲和力病例则呈阴性。该结果显示，与ELISA相结合的PCR检测比单独使用ELISA法具有更好的分析性能，也弥补了酶联试验在面对IgG亲和力分析时的不足[35]。ROOZBEHANI等[36]研究了2120份孕妇血清样本，发现结合PCR的酶联荧光法与单独进行酶联法在区分高、低风险感染和减少孕妇不必要治疗的频率方面更加可靠，多重PCR结合血清学方法对高危妊娠的检测和先天性弓形体病的诊断具有重要意义，可对IgM阳性或不明确的孕妇进行进一步明确的诊断，比单一抗体检测提高了精准性[37]。在检测孕妇的原发性急性弓形虫病中，联合诊断存在定义和选择母婴传染高危病例的可能[38]。MARTINEZ等[39]也开发出一种ELISA-PCR结合测定法用于弓形虫的检测，其与单一Southern blotting法相比具有操作更加简便，用时更短等优势。

4 结语

几十年来，对人弓形虫病的检测手段已经有了长足的进展。传统的检测手段有病原学和血清学诊断，病原学诊断方法简单，且诊断结果具有确诊意义，主要用于临床急性感染的检测，但因其检出率不高，现已较少被采用；血清学检查是目前实验室诊断弓形虫病的首选和最常用的诊断方法，方法上具有多样性，准确率也较高，许多商业化试剂盒对弓形虫病的检测带来了极大的便利性。随着基因组学和生物信息学的迅速发展，分子诊断的优势不断体现，解决了血清学检测的一些局限性，同时准确性也较高，因此寻找更多有效的相关基因位点用于检测可能是将来的研究方向。血清学、分子技术各有其优势和局限性，联合诊断由于扩展了检测的深度与广度，可能会是未来人弓形虫病诊断技术发展的趋势。