转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

刘晓贝,白树雄,王振营,王月琴,王勤英,何康来,*

(1.河北农业大学植物保护学院,河北保定 071000; 2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis是我国玉米生产上的重要害虫。常年为害会导致玉米减产10%左右，大发生年份可减产30%以上甚至绝产(周大荣,1996;王振营等,2000)。亚洲玉米螟为害亦能够加重玉米穗腐病的发生，导致玉米籽粒真菌毒素增加，影响食用安全(宋立秋等,2009)。全生育期有效表达Bt杀虫蛋白的转基因抗虫玉米为亚洲玉米螟的防治提供了新途径(Heetal.,2003;王冬妍等,2004)。截至2018年，全球已有14个国家种植了转基因玉米，种植面积达5 890万hm2，其中转基因抗虫玉米种植面积达550万hm2。转基因抗虫玉米表达的Cry1Ab,Cry1F和Vip3A蛋白是目前国际上商业化应用最广泛的用于防治鳞翅目害虫的Bt杀虫蛋白。另外，叠加多基因(如MON89034，表达Cry2Ab2+Cry1A.105;Bt11×MIR162,表达Cry1Ab和Vip3A)和聚合多基因(如MON89034×TC1507×MON88017×DAS-59122，表达Cry2Ab2+Cry1A.105,Cry1F,Cry3Bb1和Cry34/35Ab1 Bt蛋白)的抗虫玉米不仅能防治多种鳞翅目害虫，还能防治鞘翅目玉米根萤叶甲Diabroticavirgiferavirgifera(ISAAA,2018)。转基因抗虫作物不仅能够有效控制靶标害虫的危害，提高作物产量；还能减少化学农药的使用，降低环境污染(Sheltonetal.,2001;Carrièreetal.,2003)；同时能为周边种植非转Bt作物的种植者带来一定的经济效益(Wuetal.,2008;Hutchisonetal.,2010;Tabashnik,2010)。

长期大面积种植转基因抗虫玉米，也会引发靶标害虫产生抗性。2007年，在波多黎各，草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda对转cry1F基因玉米TC1507产生抗性(Storeretal.,2012)；2018年，首次在加拿大新斯科舍发现对Cry1F杀虫蛋白产生抗性的欧洲玉米螟Ostrinianubilalis种群(Schaafsmaetal.,2019)。虽然我国尚未进行转基因玉米的商业化种植，但室内汰选实验表明亚洲玉米螟可对Cry1Ab和Cry1Ac等多种杀虫蛋白产生抗性(Xuetal.,2010;王月琴等,2014;Zhangetal.,2014;Wangetal.,2016;Shabbiretal.,2018)。因此，商业化推广某一转基因抗虫玉米的同时，必须同时实施合理的抗性治理措施，以保障其长期的可持续利用。转双基因作物能够有效延缓抗性的产生，但是目前关于转双基因玉米对亚洲玉米螟的杀虫效果缺乏相关报道。因此，本研究首先测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白的表达量，同时评价了该转基因事件对亚洲玉米螟的室内杀虫效果，以期为转基因玉米的环境安全评价及靶标害虫的抗性治理策略提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

亚洲玉米螟室内敏感品系(ACB-BtS)：原始种群采自陕西省西安市，在室内无琼脂半人工饲料上连续饲养多代，饲养过程中未接触任何的Bt制剂和Bt杀虫蛋白。

亚洲玉米螟室内抗性品系：以ACB-BtS为起始虫源，在室内无琼脂半人工饲料中分别加入Cry1Ac和Cry1Ab 蛋白进行幼虫全生育期汰选，分别得到亚洲玉米螟Cry1Ac抗性品系(ACB-AcR)和Cry1Ab抗性品系(ACB-AbR)。目前均已连续筛选200代以上，Cry1Ac和Cry1Ab抗性品系的抗性倍数分别达3 500和190倍(Zhangetal.,2017)。

实验所用亚洲玉米螟品系均在温度27±1℃，相对湿度70%～80%，光周期16L∶8D的条件下饲养。

1.2 供试玉米

供试玉米为转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030及其非转基因对照玉米祥249(X249)，均由中国种子集团有限公司生命科学技术中心提供。ZZM030是以亲本对照玉米X249为受体材料，插入外源基因cry1Ab/cry1Ac以及epsps所得，同时具有抗虫和抗草甘膦除草剂的特性(张莉等,2019)。

1.3 转cry1Ab/cry1Ac基因玉米心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白表达量测定

Bt-Cry1Ab/Cry1Ac ELISA试剂盒为美国EnvirologixTM公司生产。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定转基因玉米4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的含量。测定方法同王培等(2012)，具体操作步骤如下：(1)测定开始前让所有试剂达到室温平衡；(2)裁剪清洗好的玉米叶片，用250 μL提取缓冲液提取大小为10 mm2的绿色玉米叶片；(3)向96孔酶标板的每个孔中加入50 μL Cry1Ab/Cry1Ac缀合物，之后立即加入50 μL提取缓冲液作为空白对照，加入50 μL蛋白作为阳性对照，加入50 μL样品提取物到各自孔中，对照和处理分别测定3株和7株，1株为1个生物学重复，每重复测定3次，每孔为1次重复；(4)循环移动酶标板20～30 s，彻底混合孔内液体；(5)用封口膜覆盖酶标板，防止孔内液体蒸发，并在室温下孵育1～2 h；(6)孵育后，小心取下覆盖物，洗板；(7)每孔加入100 μL底物并混合均匀，室温孵育15 min；(8)每孔加入100 μL终止液并充分混匀，使溶液呈黄色；(9)在酶标仪630 nm处测定吸光值，根据OD值和标准曲线计算蛋白含量。根据制样时所取玉米叶片鲜重计算单位组织鲜重的蛋白含量。

1.4 室内生测

转基因玉米叶片中杀虫蛋白表达量随叶片生长下降，本试验采用玉米营养生长阶段蛋白表达量相对较低时的叶片进行组织生测。

从田间采集6-8叶期的玉米植株各4～6株带回室内。剥开植株，选取内层未展开的幼嫩心叶，先用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗1遍，用滤纸吸去表面水珠后晾干。用无菌剪刀将幼嫩心叶裁剪为长和宽均为1 cm左右大小的叶片，按照每孔1～2片放入24孔细胞培养板中(Corning 3524)。每孔接入1头待测试品系的初孵幼虫(孵化后0～12 h)，之后用封膜机将孔口封住，防治幼虫逃逸。用解剖针在每孔封口膜上扎孔，保证空气流通。将培养板放置于27±1℃，相对湿度70%～80%，光周期16L∶8D的条件下饲养。试验共设置6个处理，每个处理为3次重复，每重复为24头初孵幼虫。

接虫后每2 d调查1次，根据叶片组织被取食情况随时添加或更换相同来源的新鲜叶片，并记录幼虫存活数(用毛笔轻触幼虫尾部，若幼虫不动，视为死亡；若单头存活幼虫重量<0.1 mg，按死亡计算)。试验观察到第6天为止。

1.5 数据分析

采用t检验检验转基因玉米4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达量之间的差异显著性；不同亚洲玉米螟品系幼虫分别取食转基因玉米和对照玉米叶片后的存活率间差异显著性检验采用t检验，百分数进行了反正弦转换。当任一处理或对照所有重复的存活率为100%或0时，则不进行统计检验。所有统计分析过程采用SPSS 22.0软件计算。

2 结果

2.1 转基因玉米心叶中杀虫蛋白表达量

根据ELISA定量结果，转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030 4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别为10.62±2.00和2.94±1.08 μg/g FW，二者差异显著(t=3.389,df=12,P=0.005)(图1)。

图1 转cry1Ab/cry1Ac基因玉米心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达量Fig.1 Expression level of Cry1Ab/Cry1Ac fusion protein in whorl leaves of transgenic cry1Ab/cry1Ac maize图中数据为平均值±标准误；柱上不同小写字母代表经t检验差异显著(t=3.389,df=12,P=0.005)。Data in the figure are mean±SE.Different lowercase letters above bars indicate significant differences according to t-test (t=3.389,df=12,P=0.005).

2.2 取食不同玉米心叶后不同亚洲玉米螟品系的存活率

室内生测结果(表1)表明：ACB-BtS初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d后的存活率仅为23.6%，4 d后存活率为0，而取食非转基因玉米X249心叶4 d后的幼虫存活率高达93.1%。ACB-AbR初孵幼虫取食ZZM030叶片2,4 和6 d后，存活率均显著低于取食X249对应的存活率；6 d 后有11.1%的个体存活，但存活个体较小，发育受到严重抑制；而取食X249叶片的初孵幼虫发育正常，且6 d后的幼虫存活率高达81.9%。ACB-AcR初孵幼虫取食不同玉米心叶后的存活率存在显著差异，6 d后取食ZZM030的存活率仅为12.5%，而取食X249的初孵幼虫存活率高达77.8%。结果说明，转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030对不同品系的亚洲玉米螟均具有良好的防治效果。

表1 取食不同玉米心叶不同天数后不同品系亚洲玉米螟初孵幼虫的存活率(%)Table 1 Survival rates (%) of the neonates of different strains of the Asian corn borer Ostrinia furnacalis fed on the whorl leaves of different maize lines for different days

3 讨论

转基因抗虫作物高剂量表达目的杀虫蛋白是转基因作物可持续应用的关键。据报道，靶标害虫在田间对转基因抗虫作物产生抗性是由于目的杀虫蛋白的非高剂量表达。例如，在波多黎各，表达Cry1F杀虫蛋白的转基因玉米TC1507对草地贪夜蛾的防治效果一般，使得田间抗性种群产生，导致该转基因事件被强制召回(Storeretal.,2012)。2009 年，在田间监测到玉米根萤叶甲的抗性种群，转基因玉米中Cry3Bb1杀虫蛋白的非高剂量表达和适合度代价是该靶标害虫产生抗性的主要原因(Gassmannetal.,2011)。因此，转基因作物中目的杀虫蛋白表达量的高低将直接影响该作物对于靶标害虫的防治效果。在玉米心叶期，亚洲玉米螟初孵幼虫主要为害取食未展开的幼嫩心叶，所以明确玉米心叶中目的杀虫蛋白的表达量对于转基因玉米的杀虫效果评价具有重要意义。因此，本研究测定的转cry1Ab/cry1Ac基因玉米4叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白的表达量分别为10.62和2.94 μg/g FW(图1)，该转基因玉米在这两个时期心叶中杀虫蛋白表达量均高于中国不同地理种群亚洲玉米螟对Cry1Ab蛋白的敏感基线LC50(0.10～0.81 μg/g)(Heetal.,2005)。生测试验明确了转cry1Ab/cry1Ac玉米ZZM030对ACB-BtS品系具有很好的杀虫效果，4 d后杀虫效果达到100%。这对于今后转基因玉米的商业化种植，制定“高剂量”策略延缓抗性的产生具有重要的指导意义。

已有研究表明，室内汰选的Cry1Ab抗性品系亚洲玉米螟可在转cry1Ab基因玉米(MON810)的花丝上存活并化蛹(Xuetal.,2010)；也有研究表明，室内汰选的Cry1Ac抗性品系亚洲玉米螟对转cry1Ac基因玉米(Zh58Ac)的敏感性降低(Jiangetal.,2016)，在取食转cry1Ac基因玉米(BT799)的花丝、苞叶和籽粒7 d后的存活率为81.3%～97.2%(王月琴等,2014)。这些研究结果均说明亚洲玉米螟有对田间转基因抗虫玉米产生抗性的风险。本试验通过评价转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030对ACB-AbR和ACB-AcR品系的杀虫效果，进一步明确该转基因玉米对玉米螟的抗性。结果表明：ACB-AcR和ACB-AbR品系在取食转基因玉米ZZM030叶片6 d后虽然仍有少数存活(表1)，但是存活幼虫的发育受到严重抑制，表明ACB-AcR和ACB-AbR品系对转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030具有一定的抗性。该研究结果一方面说明转基因玉米的抗虫性状为功能显性，另一方面说明转基因玉米的抗虫效果可能是玉米自身抗虫物质和Bt杀虫蛋白相互作用的结果，在欧洲玉米螟Dipel抗性品系中有相似的现象(Huangetal.,2002)。

靶标害虫对Bt杀虫蛋白产生抗性是一种生物进化现象，是抗性基因被杀虫蛋白选择的结果。适合度指生物在所处环境中能够生存并把它的特性遗传给下一代的相对能力。因此，处在Bt选择压下的抗性基因型适合度一般比敏感基因型适合度高，但是，当不接触Bt杀虫蛋白时，抗性基因型的适合度一般表现为不利，即适合度劣势(Tabashnik,1994;郭芳等,2009)。如对Vip3A产生抗性的草地贪夜蛾幼虫在常规高粱上的发育历期和蛹重显著低于敏感品系(Chenetal.,2018)。本研究结果表明，同ACB-BtS敏感品系相比，取食非转基因玉米X249相同天数后ACB-AbR和ACB-AcR两个抗性品系存活率较低，但与ACB-BtS品系相比无显著差异(P>0.1)，说明取食常规玉米时亚洲玉米螟抗性品系不存在适合度劣势，而在抗性治理过程中，适合度劣势有利于延缓抗性的产生。