参苓护肝胶囊定性鉴别和芍药苷含量测定方法的研究

段立广 王东晗 安绯悦 闫 凯*

（1、河北医科大学第一医院 药学部，河北 石家庄050000 2、河北省药品医疗器械检验研究院化学药品检验室，河北 石家庄050000）

肝脏疾病诱发原因众多，是一种常见的危害性极大的疾病。参苓护肝胶囊由白术、茯苓、白芍、赤芍等12 味药材组成，胶囊内容物棕褐色、粉末、味苦，具有健脾益气疏肝、保肝护肝的功效。参苓护肝胶囊作为河北医科大学第一医院的院内制剂，在探索中医药学治疗慢性肝病方面取得了良好的临床疗效。经临床观察显示，参苓护肝胶囊能降低谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），并能有效防止慢性肝病再次复发的危险。查阅相关文献，尚未发现有关参苓护肝胶囊的质量标准研究，本文建立了HPLC 法测定参苓护肝中芍药苷含量的方法[1,2]，同时采用薄层色谱法对参苓护肝中白术、茯苓、白芍等成分进行了定性鉴别[3-5]，为参苓护肝胶囊质量标准的建立提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（PDA 检测器，美国Agilent 公司）；超声波清洗仪（KQ-500KDE，昆山市超声仪器有限公司）；自动点样仪（Linomat-5，CAMAG 公司）；万分之一电子天平（AE240，上海梅特勒仪器有限公司）；超纯水制备机（Millipore 公司）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：110736-201438，纯度＞98%）、白术对照药材（批号：120925-200708）、茯苓对照药材（批号：121117-200504）均购自中国食品药品检定研究院。三批参苓护肝胶囊样品来自河北医科大学第一医院，党参、白术、茯苓、柴胡、木香、厚朴、当归、白芍、赤芍、法半夏、郁金、甘草经河北医科大学第一医院中药室郭俊利中药师鉴定。乙腈（色谱纯），水（超纯水），其它试剂（分析纯）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 茯苓

称取参苓护肝胶囊内容物5g，置于圆底烧瓶中，向其中加入乙醚30ml，加热回流提取30min，滤过，将滤液蒸发至干，加入1ml 甲醇溶液将残渣溶解，作为供试品溶液。另取茯苓对照药材，同供试品制备方法制备，作为对照药材溶液。按处方比例制成不含茯苓药材的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制备没有茯苓的阴性对照溶液。依照薄层色谱法（通则0502）试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液以及阴性对照溶液各10μl，点于同一硅胶G 薄层板上，将石油醚、乙酸乙酯、甲酸按照24：5：1 的比例配置成为混合溶液并用作展开剂使用，预饱和30min，展开，展距15cm，取出，晾干，置于紫外光灯365nm 波长下进行检视。如图1 所示，在与对照药材色谱相应的位置上，供试品色谱中显示有相同颜色的荧光斑点，而阴性对照色谱中没有此类荧光干扰。

2.1.2 白术

图1 茯苓薄层色谱鉴别结果

取参苓护肝胶囊内容物5g，加正己烷30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加1ml 正己烷溶液使溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材，同法制备对照药材溶液。按处方比例制成不含白术药材的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备缺白术的阴性对照溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷- 异丙醇(50：1) 为展开剂，预饱和30min，展开，展距15cm，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照色谱无干扰，结果见图2。

图2 白术薄层色谱鉴别结果

2.1.3 白芍、赤芍

称取参苓护肝胶囊内容物5g，加入30 ml 无水乙醇，使用超声处理30min，滤过，采用水浴加热的方法将滤液蒸干，用20ml 蒸馏水将残渣溶解，每次使用15ml 的乙醚将其萃取，连续萃取3 次，萃取完成后弃去乙醚层；水层用15ml 水饱和的正丁醇连续萃取3 次，萃取后合并正丁醇层并将其水浴蒸干，用1ml的乙醇将残渣溶解，将其作为供试品溶液。另外称取芍药苷对照品少许，加乙醇配制成1mg/mL 的对照品溶液。按照处方比例，称取除白芍和赤芍外的其他药材，制备没有白芍和赤芍的阴性样品，按照供试品溶液的制备方法制成没有白芍和赤芍的阴性对照溶液。按照薄层色谱法（通则0502）试验，分别吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10μl，点于同一硅胶G 薄层板上。将氯仿、甲醇、甲酸按照20：5：1 的比例配置成为混合溶液并用作展开剂使用，预饱和30min，展开，展距15cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。如图3所示，在与对照品色谱相应位置上，供试品色谱中显示有相同颜色的斑点，而阴性对照色谱中没有此类荧光干扰。

图3 白芍、赤芍薄层色谱鉴别结果

2.2 芍药苷的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Accliam C18(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：乙腈(A) -0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱：0～7min，7%A→15%A；7～20min，15%A→30%A；检测波长为230nm；流速：1.0ml·min-1；柱温：30℃；进样量：10μl；理论板数按芍药苷峰计大于3000。

2.2.2 对照品溶液的制备

取芍药苷对照品适量，精密称定，加适量甲醇溶解并稀释成浓度为0.785 mg·ml-1的对照品储备液。精密量取芍药苷储备液2.0ml 置于50ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备

取参苓护肝胶囊内容物0.5g，精密称定，置锥形瓶中，加入15ml 甲醇，超声提取2 次，每次30min（功率400W，频率40kHz)，合并上清液，水浴蒸干，残渣用20ml 蒸馏水溶解，用乙醚萃取3次，每次15ml，弃去乙醚层；水层用水饱和的正丁醇萃取3 次，每次15ml；合并正丁醇层，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至25ml 容量瓶中，即得供试品溶液，备用。

2.2.4 阴性样品溶液的制备

按处方比例及制备工艺，将药材粉碎后，制成缺白芍和赤芍的阴性样品，并按“2.2.3”项下方法制备阴性样品溶液，即得。

2.2.5 专属性

取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图4。结果供试品色谱与对照品色谱色谱峰保留时间一致，阴性样品相同保留时间无色谱峰，不干扰测定，且待测成分与其他物质分离良好。

图4 供试品（A）、阴性样品（B）、芍药苷对照品（C）色谱图

2.2.6 线性关系

取芍药苷对照品适量，精密称定，配置成系列浓度的对照品溶液，分别吸取10μl 注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得芍药苷线性方程Y=138.7X-3.966，r=0.9999，线性范围0.01816～2.797μg，结果表明芍药苷标准曲线在线性范围内有良好线性关系。

2.2.7 精密度试验

取参苓护肝样品0.5g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，连续进样6 次，芍药苷峰面积RSD 为0.81%。结果表明，仪器具有良好的精密度。

2.2.8 稳定性试验

取参苓护肝样品0.5g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备成供试品溶液，分别在0，3，6，9，12，15h 注入液相色谱仪，记录峰面积。结果芍药苷峰面积RSD 为1.19%，表明供试品溶液在室温条件下15h 内稳定。

2.2.9 重复性试验

取同一批参苓护肝胶囊样品约0.25g、0.5g、0.75g 各三份，精密称定，按“2.2.3”项下方法平行制备9 份供试品溶液，测定含量。计算得芍药苷的平均含量为3.6102mg·g-1，RSD 为2.11%，结果表明，本实验方法重复性良好。

2.2.10 回收率试验

取已知含量同一参苓护肝样品0.25g，共9 份，精密称定，每三份为一组，分别精密加入低、中、高三个浓度的芍药苷对照品溶液5ml，按“2.2.3”项下方法配制成回收率供试品溶液，依次进入液相色谱仪，测定回收率。芍药苷的平均加样回收率为101.47%，RSD 为2.52%，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n=9）

2.2.11 样品含量测定

取3 批参苓护肝样品各0.5g，精密称定，按“2.2.3”项下方法平行配制供试品溶液各3 份，依照“2.2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积并用外标法计算样品中芍药苷的含量，结果见表2。

表2 参苓护肝样品中芍药苷含量（n=3）

3 讨论

本实验采用薄层色谱法对参苓护肝胶囊中茯苓[6]、白术[7-9]、白芍和赤芍[10-11]进行了定性鉴别。在茯苓薄层鉴别实验时，比较了乙醚和乙醇不同提取溶液，超声和加热回流不同提取方法对色谱斑点情况的影响。研究发现，乙醚加热回流提取法的薄层色谱斑点清晰，圆整。同时比较了石油醚- 乙酸乙酯(4：1)，石油醚- 丙酮- 乙酸乙酯(84：15：1)，石油醚- 乙醚(3：2)，石油醚-乙酸乙酯- 甲酸(24：5：1)不同展开剂对色谱分离情况的影响，发现石油醚- 乙酸乙酯- 甲酸(24：5：1)作为展开剂时，分离较好，无边缘效应。

在HPLC 法测定芍药苷含量的方法研究中[12-13]，对供试品提取液进行了乙醚和水饱和正丁醇的多次萃取操作，这样大大降低了其他物质对芍药苷色谱峰的干扰，使高效液相色谱基线更平稳。并比较了乙腈- 水，甲醇- 水，乙腈-0.1%磷酸水，乙腈-0.1%冰乙酸水，乙腈-0.05%磷酸水等不同流动相梯度洗脱时峰的分离度和峰形，实验发现乙腈-0.1%磷酸水为流动相时峰的分离度与峰形较好。

本研究建立了薄层色谱法对参苓护肝胶囊中白术[14]、茯苓、白芍、赤芍定性鉴别的方法和HPLC 法测定参苓护肝中芍药苷含量的方法，建立的薄层色谱法分离度好，专属性强，操作简便快捷，高效液相色谱法精密度高，重复性好，结果准确可靠，本实验为参苓护肝胶囊的质量控制和质量标准的建立提供了科学依据。