细菌耐药性的拉曼光谱快速检测研究进展

张 萍， 褚东辰， 陈可仁， 刘泳麟， 罗瑞鹤， 刘 洋， 郑大威

(北京工业大学生命科学与生物工程学院， 北京 100124)

抗生素(antibiotics)是治疗细菌性感染的重要药物，伴随着抗生素的发展，抗生素滥用诱发的细菌耐药性问题变得日益突出，使得临床上常用抗生素的可选择性降低，增加了治疗难度和治疗成本[1]. 全国耐药细菌监测网发布的2017年全国细菌耐药监测报告显示，某些致病菌对其治疗使用的抗生素的耐药检出率已达五成以上，例如肺炎链球菌对红霉素的耐药率高达95.0 %，甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌在中国的平均检出率为76.0%，大肠埃希菌对头孢曲松或头孢噻肟的耐药率已达54.2%，对左氧氟沙星或环丙沙星的耐药率全国平均为51.0%，鲍曼不动杆菌对亚胺培南或美罗培南的耐药率全国平均为56.1%[2]. 据世界卫生组织估计，抗生素耐药性每年造成70万人死亡，如果该问题无法得到解决的话，到2050年，由抗生素耐药引发的死亡人数将达到1 000万人[2].

抗生素治疗的效果受到细菌抗生素耐受性的影响. 细菌耐药性的快速检测是临床上快速诊断病因、合理使用抗生素和掌握耐药性产生过程的关键，对于保护人类健康具有重要意义. 然而，由于细菌耐药性的产生机制复杂多样，分为天然耐药性和诱导耐药性，与细菌产生灭活酶、改变细胞壁的通透性、遗传突变、抗生素作用靶点的改变、增加药物外排以及生物被膜的形成等都有密切的关系，这些因素增加了细菌抗生素耐药性快速检测的难度. 现有依赖培养的方法在应对食品和生物医学领域的公共突发事件时，仍然无法满足临床快速诊断的不同分析要求.

拉曼光谱技术是对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种光谱分析方法. 作为一种振动光谱技术，拉曼光谱具有光谱学快速检测的优点，通过特定的光谱模式识别，高特异性地观察生物分子的变化，同时不受水的干扰，非常适合生物医学体系的研究. 在过去的10年里，拉曼光谱技术在临床诊断中的应用研究获得了越来越多的关注. 不同种属的细菌细胞具有不同的结构信息，拉曼光谱作为反映生物大分子特征振动信息的“指纹光谱”技术，在微生物检测、鉴别、分类、代谢等领域的研究已经取得丰硕的研究成果，体现出较高的特异性、准确度及灵敏度[3]. 在抗生素治疗过程中，通过监测细菌的拉曼光谱信息变化，并且结合多元统计分析，可实现对细菌耐药性和敏感性的快速定性鉴别[4-5]. 拉曼光谱与显微技术的结合，在免培养的条件下即可对单细胞进行检测，大大缩短样本前处理和检测时间，同时为细菌耐药的细胞异质性检测提供快速的技术手段[6-7]. 拉曼光谱技术与稳定同位素标记相结合，为细菌耐药谱及耐药程度的定性和定量分析检测提供了技术支撑[8]. 近些年，表面增强拉曼光谱技术以及仪器的小型化、便携化的发展，大大提高了检测的灵敏度，为实现致病菌及耐药性的现场、快速检测提供了巨大的发展空间[9-10]. 本文将对拉曼光谱的原理和用于细菌检测的拉曼光谱技术进行简单的介绍，重点围绕近5年拉曼光谱技术在细菌耐药性检测方面的研究进展进行综述.

1 细菌耐药性的检测方法

抗生素耐药性是指在短时间内细菌细胞暴露于致死浓度的抗生素处理时仍然能够存活下来. 细菌耐药性的产生受众多因素的影响，耐药机制复杂多样，导致了耐药菌快速检测的难度增加[1]. 目前，细菌的耐药性检测主要依赖于培养法、自动仪器检测、分子检测及酶实验等. 其中传统的微生物学培养法，包括分离培养、生化鉴定、肉汤稀释法、纸片扩散法、E-test等，具有较高的准确度，但是培养过程耗时(2～3 d)、灵敏度低，这期间医生只能依靠经验性治疗，并且对于难以培养的细菌无能为力，亦无法揭示耐药机制. Vitek-2、Pheonix、Microscan等自动检测仪器主要运用折点敏感试验的原理，半定量测定抗菌药物的最小抑菌浓度值(minimal inhibit concentration, MIC)，依赖于细菌培养过程，对新的耐药株无法检测. PCR、ELISA等分子生物学和免疫学的技术，可在短时间内获得结果，但PCR技术由于操作易污染，很难避免假阳性结果的产生，ELISA实验抗体间可能产生交叉反应，这些弊端至今仍未克服. 基因芯片检测和质谱技术尽管表现出了高灵敏度和高特异性，却因为受限于成本昂贵和操作繁复的缺点，在应对食品和生物医学领域公共突发事件时，无法满足临床诊断等各种分析的不同要求[11]. 目前，尽管围绕细菌耐药性的基础研究已有大量文献报道，通过检测细菌感染的标志物能快速筛查预警，也有些试剂盒通过FDA的批准，但细菌对多数抗生素的耐药机理至今仍未彻底阐明，从而限制了基因检测法的广泛应用. 因此，临床上急需一种快速、灵敏、准确的新方法，用于致病菌及耐药性的有效监测.

2 细菌检测的拉曼光谱技术

2.1 常规拉曼光谱技术

拉曼散射(Raman scattering，RS)效应由印度科学家Raman于1928年发现. 光照射到物质上会发生弹性散射和非弹性散射，其中大部分的光子发生弹性散射，又称为瑞利散射，仅约为入射光10-6的光子发生非弹性散射，在这个过程中，散射光子的频率小于入射光子的频率，称为斯托克斯线(Stokes)，散射光子的频率大于入射光子的频率，称为反斯托克斯(anti-Stokes)，Stokes线和反Stokes线统称为拉曼谱线，在瑞利线的两侧等距离分开. 由于在通常情况下，绝大多数分子处于振动能级基态，因此，Stokes线的强度远远强于反Stokes线，被认为是常规拉曼光谱(normal Raman spectroscopy, NRS). 作为一种振动光谱技术，拉曼光谱具有与红外光谱相似并互补的特点，通过特定的光谱模式识别，高特异性地观察分子的结构与变化. 将振动光谱技术用于微生物的检测研究始于1950—1960年，最初采用的是红外光谱技术，但红外光谱易受水的干扰，因而限制了它在生物样品分析上的应用. 拉曼光谱检测可以水为介质，使样品在接近自然、活性状态下研究生物大分子的结构及其变化，对样品具有直接、无损检测的特点，因而更适用于生物体系的研究. 但是由于常规拉曼光谱信号弱、灵敏度低、设备高昂等，将它用于细菌研究的受限因素还比较多. 之后的10年间，随着激光器的发展，将拉曼光谱用于细菌中核酸、细胞色素、酶、光合蛋白、膜蛋白等生化组分的研究陆续被报道.

理论上，不同种属细菌细胞的结构信息与分子组成各不相同，拉曼光谱是反映生物大分子结构(蛋白质和脂类、糖类、核酸等)特征振动信息的叠加图谱，因此，通过拉曼信号记录细菌细胞的大分子结构组成的变化，并结合多元统计分析方法可以快速区分不同种属的细菌. 然而，由于普通拉曼信号较弱，生物本身存在荧光干扰，获得理想的细菌拉曼信息存在较大的困难，因此，采用常规拉曼光谱检测主要还是依赖培养的方法收集大量的细菌细胞，这样虽然摆脱了烦琐的生化鉴定步骤，但实际上并未达到真正快速检测的目的.

2.2 表面增强拉曼光谱技术

将吸附在特殊制备的一些金属良导体表面或纳米贵金属溶胶中的被测分子的拉曼信号显著放大的现象称为表面增强拉曼散射效应(surface enhanced Raman scattering, SERS). SERS技术的出现极大地提高了检测的灵敏度、准确度及特异性. 1998年，Efrima等[12]采用银溶胶首次利用SERS技术实现对革兰氏阳性菌和阴性菌的鉴定，此后，SERS在细菌检测、鉴定、分类方面的应用研究得到了迅速的关注. 目前，采用的增强基底除了非标记的纳米级金属粗糙表面、纳米金、银溶胶外[10，12-13]，还包括基于免疫标记技术的纳米增强探针、微阵列结构等[14-15]. 非标记的SERS检测，增强基底合成方法简单、操作简便、灵敏度高，可实现对未知细菌的快速鉴别，大大缩短了检查时间，被应用于不同种属细菌的鉴别[10，12-13]，监测细菌不同生长阶段引起的代谢变化等[16-17]. 使用激光光镊拉曼光谱技术(laser tweezers Raman spectroscopy, LTRS)表征不同生长阶段大肠杆菌的拉曼指纹特性，发现DNA和RNA的拉曼峰强度随着细菌的生长逐渐降低，而蛋白质特异性的拉曼振动则以不同的速率增加[18]. Zhou等[13]采用银纳米颗粒作为增强基底检测饮用水中的细菌污染状况，发现银颗粒覆盖在细菌的细胞壁，细菌的拉曼信号得到极大增强，该方法检测时间短、流程简单、灵敏度高、样品量少，能够对大肠杆菌和表皮葡萄球菌进行快速区分. Kairyte 等[16]采用非标记的SERS技术快速检测李斯特菌、沙门氏菌和大肠杆菌，将细菌表面的腺嘌呤和半胱氨酸的拉曼信号强度作为依据，实现了对3种细菌的快速鉴别. Zheng等[10]采用以金溶胶为增强基底的非标记方法，利用便携式拉曼光谱仪对复合菌污染类型的快速筛查可在6 h内完成. SERS具有较高的检测灵敏度，采用非标记的方法对活菌和死菌进行快速检测，发现活的菌体具有较强的拉曼信号，而死菌检测不到，与我实验室的观察结果相一致[10，17].

增强基底的改良、修饰与功能化不断提升检测的灵敏度和特异性，只需要少量菌体，如每毫升溶液中只需几十到几百个细菌，即可获得高质量的拉曼信号，免疫标记的纳米增强探针在特异性检测中发挥着重要的作用. Guven等[19]将生物素标记的抗大肠杆菌抗体固定在亲和素包被的纳米磁珠上分离浓缩大肠杆菌，用2-硝基苯甲酸作为拉曼探针的棒状金纳米颗粒增强基底对大肠杆菌进行定量SERS检测，定量限可达24 CFU/mL，总耗时不超过70 min. Kearns等[20]采用凝集素修饰纳米磁珠的方法收集细菌菌体，然后使用SERS活性基底特异性检测病原菌，对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最低检测浓度可达10 CFU/mL，还可实现对同一样品中这3种混合菌的同时快速检测. Yuan等[21]采用4-巯基苯基硼酸(4-MPBA，作为拉曼标记和内标)修饰的金镀银氧化石墨烯(Au@Ag-Go)纳米复合物作为增强基底，并结合抗菌肽功能化修饰纳米磁珠的方法收集细菌菌体，对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的最低检测浓度可达10 CFU/mL，同时可用于混合感染的检测[20-21]. SERS技术并成功用于尿路感染病原菌的快检，可快速识别大肠杆菌、变形杆菌和克雷伯菌，准确率达到94%，灵敏度大于95%，特异性达到99%，总耗时1 h，包括从尿液中离心浓缩收集检测病原菌[22-23].

SERS具有更高的信噪比和检测灵敏度，随着增强基底的不断改良与完善，甚至可以达到单分子水平的检测，在接近自然状态下，直接、无损伤地研究生物大分子的结构及其变化，将使其应用于活细胞等复杂系统的检测越来越成熟.

2.3 共聚焦拉曼显微光谱技术

显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱技术和显微分析技术结合起来的一种应用技术. 1975年，开创性地将拉曼检测应用到显微分析技术研究中，1990年，第一台共聚焦拉曼显微光谱仪(confocal Raman microspectroscopy, CRMS)诞生，1998年首次被应用于体外单细胞的检测研究. 显微拉曼光谱具有微观、原位、多相态、稳定性好和空间分辨率高等特点，能够从样本中直接分离出单个致病菌进行检测，是一种免培养、非标记的方法，大大缩短样本前处理和检测时间，尤其适用于体外难以培养的微生物，做到真正的快速检测[24]. 此外，共聚焦拉曼显微光谱仪可实现逐点扫描，获得高分辨率的三维图像，即拉曼成像技术，广泛被用于药物作用靶点及作用动力学分析方面.

共聚焦拉曼光谱技术的出现，及其与表面增强拉曼散射效应的结合，使其具有超高的灵敏度和空间分辨率，不需要对生物材料进行标记，即可从单细胞及亚细胞水平收集生物大分子的拉曼信息，被广泛用于水样[25]、生物样品[26-27]、食品[28]、环境[29]中的微生物鉴定，不仅能够鉴别不同种属、不同亚种细菌细胞间的差异，而且还可检测同一菌株在不同生长时期生理状态上的细微差异，以及在药物作用下对细菌生化代谢的影响[30].

生物材料在检测时容易受到自身荧光的干扰. 激发波长小于260 nm的紫外共振拉曼光谱技术(UV resonance Raman spectroscopy, UVRRS)能有效避免生物背景荧光的产生，可将菌体的拉曼信号放大几个数量级. 通过选择特定的激发波长对于表征细菌中特定的大分子非常有效，如231 nm的激发波长能特异性检测芳香族氨基酸，251 nm的激发波长可大量获取核酸的拉曼信号. 此外，共振拉曼光谱(resonance Raman spectra, RRS)、相干反斯托克斯拉曼光谱(coherent anti-Stokes Raman scattering, CARS)、尖端增强拉曼光谱(tip enhanced Raman scattering, TERS)、受激拉曼光谱(stimulated Raman scattering, SRS)也被用于微生物的检测研究. 随着CCD技术、3D技术及光纤探头的发展，研究的重点逐渐转向活体组织的in vivo检测研究，在生命科学、医学卫生等领域中逐渐彰显出优势.

3 拉曼光谱检测细菌耐药性

细菌耐药性的快速鉴别是生物医学领域亟待攻克的重要难题. 目前，培养法仍是主流通用标准，但对于临床常见致病菌，培养法耗时长，难以揭示耐药机制，对于难以培养或生长缓慢的细菌无能为力. 临床上为了指导“精准用药”“个性化用药”，急需细菌耐药性及其耐药机制检测的快检技术. 近些年来，随着拉曼光谱技术的发展以及与其他技术的融合，在抗生素耐药性领域取得了突破性的进展，为细菌耐药性研究提供了巨大的发展空间.

3.1 鉴定区分耐药菌与敏感菌

大量研究报道，抗生素耐药菌和敏感菌相比，分子结构上存在差异，通过收集二者的拉曼光谱信息并结合多元统计分析，可实现对耐药菌和敏感菌的快速区分. 德国耶拿大学的Popp课题组在细菌及耐药性检测方面取得丰硕的研究成果，提出采用拉曼光谱进行药物诊断的基本概念，拉曼光谱在尿路感染病人体液中细菌的检测和识别的应用，以及抗生素耐药或敏感细菌的快速光谱定性和定量检测分析等[30].

在万古霉素敏感性肠球菌中，万古霉素通过氢键与新生细胞壁中肽聚糖五肽前体D-丙氨酰-D-丙氨酸结合，阻止细胞壁的进一步合成，导致细胞死亡，而在抗性菌中，抗生素触发了D-丙氨酰-D-乳酸末端的合成，减少与这种新的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的结合，因此，万古霉素处理时耐药菌可以继续存活，不会导致细胞死亡. 用万古霉素处理粪肠球菌敏感菌株ATCC 29212和抗性菌株ATCC 51299半小时后，拉曼光谱可检测到药物诱导的变化，结合偏最小二乘法回归和线性判别分析建立分类模型，能可靠地区分抗生素处理和未经处理的细菌，在3.5 h内表征出肠球菌对万古霉素的耐药性，同时在没有任何菌株信息的情况下，准确地从2种不同的肠球菌中识别出耐万古霉素肠球菌，对临床上抗性菌株的检测具有参考应用价值[31].

3.2 耐药程度的检测

MIC即抗菌药物在18～24 h内体外抑制培养病原菌生长的最低药物浓度，目前是评价药物抗菌活性和临床制定抗菌治疗方案的主要参考依据. 然而，耐药性存在细胞异质性差异，而MIC检测是基于被测细菌细胞具有一致性的特征而设计，因此，具有一定的局限性. 徐健等[5]提出基于“拉曼组”变化的细菌耐药性快检技术，以大肠杆菌为研究对象，定量考察了抗生素、醇类、重金属等化学药物在多个剂量、给药时间、细胞抗性条件下大肠杆菌的拉曼组变化，以表征其耐药性；采用稳定同位素的标记(D2O)与单细胞显微拉曼光谱相结合的手段，对微生物的代谢过程进行精确的表征，根据2 040～2 300 cm-1波段的碳氘振动变化，可在单细胞水平监测药物对细胞的抑制作用[8]，据此可用于快速定量评价药物的MIC，对变形链球菌耐药性的检测仅需几个小时，该方法还能用于定量评估不同细胞对药物的异质性差异，对于治疗隐匿性或复发感染具有重要意义[8，32]. 非标记的方法因具有简单、快捷、实时等优点被广泛使用. Germond等[33]采用非标记的方法，以实验室筛选的对不同抗生素产生抗性的11株大肠杆菌为研究对象，预测了大肠杆菌获得性耐药的拉曼光谱标识，并且验证了耐药基因的表达与特征拉曼峰的峰强度具有显著的相关性(P< 0.05).

3.3 药物作用靶点分析

开发新的抗生素是对抗细菌耐药性的主要手段. 新抗生素的研发面临的巨大挑战是检测有多少药物分子进入到细胞内部，以及在细胞内的分子靶点. 因此，研究抗生素在体内的分布及药代动力学是了解抗生素的作用机制以及细菌抗药性产生的关键问题. 有些细菌感染属于胞内感染，并且被细胞外基质、生物膜等包被，因此，细菌接触到的药物浓度并不能真实地反映组织或器官中的药物浓度. 药物处理细菌后，将细菌冷冻干燥处理，采用显微拉曼光谱技术收集单细胞拉曼光谱信息，通过显微成像可测量细胞摄取药物的动力学特征，检测药物进入细胞的数量以及药物- 靶点相互作用的信息[34]，结合化学计量学的方法，通过建模预测未知药物的作用靶点[4，34]. 使用LTRS检测头孢唑林处理后大肠杆菌的光谱变化，发现与DNA和RNA相关的拉曼峰的强度随着细菌的生长逐渐降低，而蛋白质特异性的拉曼振动则以不同的速率增加，这些潜在的拉曼标记物可以用来鉴定大肠杆菌对抗生素治疗的反应[18]. Bernatova等[35]利用克林霉素处理表皮葡萄球菌，发现DNA的拉曼信号无明显变化，而经环丙沙星处理后的DNA拉曼光谱强度下降，表明DNA发生了断裂，据此可知环丙沙星对表皮葡萄球菌的作用靶点是DNA. Wang等[36]将氨苄西林和环丙沙星作用乳酸乳球菌，发现细菌与抗生素作用一段时间后，细菌细胞壁发生变化的同时与此所对应的细菌的SERS光谱也会随着抗生素不同的作用方式而出现差异，借助于主成分分析可以使这些差异更加可视化. 由于药物作用引起的细菌代谢的改变有时很难在拉曼光谱中清晰地可视化，因此通常需要将拉曼数据与多变量分析相结合. Neugebauer等[37]使用UVRRS检测芽孢杆菌和表皮葡萄球菌在氟喹诺酮类药物(环丙沙星、莫氟沙星)不同浓度处理时的细菌应答，通过比较处理组和未处理组的光谱差异和PCA-HCA分析，发现光谱上的差异是由氟喹诺酮与旋转酶-DNA复合物相互而引发，据此可以快速预测未知药物的作用机制. Assmann等[38]发现万古霉素处理粪肠球菌30 min即可观察到细菌的拉曼光谱变化，采用偏最小二乘回归和线性判别分析可将差异可视化，建立了基于拉曼光谱变化预测万古霉素治疗效果的数据模型，模型的准确度达到90%以上，通过对抗生素- 病原体的拉曼表征，为快速的药敏实验鉴定提供新方法.

3.4 细菌耐药异质性检测

细菌细胞的异质性特征与抗生素的治疗效果及感染机制密切相关. 在感染期间，细菌群体会分化成具有不同生理特性的亚群，休眠或外排功能活跃的细菌能够耐受抗生素的治疗，具有特定增长速率的细菌会引起持续性感染. 为了提高有效治疗，往往需要加大药物浓度，使不同细菌亚群都会受到攻击，否则，即使是小部分的“幸存者”都会导致疾病复发或产生耐药菌. 因此，在感染和抗生素治疗期间，正确评估细菌的生理状态显得尤为重要. 由于细菌具有大量的突变型，利用细菌种群的平均值往往不能真实地反映实际情况，因此，在单细胞水平上检测研究抗生素对细菌细胞的作用需要寻找新的方法并完善现有技术手段. 共聚焦显微拉曼光谱技术能够对从样本中直接分离出的致病菌进行逐个检测，在无损的状态下，获得单细胞及亚细胞细微的化学结构信息，结合拉曼成像准确测量给药过程中不同细菌细胞的异质性变化，如药物在细胞中的分布与动力学变化，药物与细胞的相互作用等，为耐药性的变迁和耐药机制研究提供了便利的工具. Schuster等[39]在单细胞水平上用CRMS技术研究细菌种群异质性，发现具有分子组成和生理特征不同的细菌亚群因其具有不同的拉曼光谱而容易被区分. Stöckel等[40]采用CRMS方法鉴定孢子的活力，实验利用不同的化学和物理方法降低细菌孢子的活力，通过光谱的差异比较，发现一些杀菌剂仅影响细菌群落的一部分，并非所有的孢子都被灭活.

4 展望

在拉曼光谱技术发现之初，光源的选择、仪器制造工艺和增强基底的制备都限制了拉曼光谱技术在生物医药领域的应用. 激光光源的引入大幅提升了激光功率，成为理想光源，使拉曼光谱技术和应用得到了发展. 拉曼光谱在高浓度治疗性药物检测和无标记的感染病原菌监测方面得到了飞速发展，通过收集病原体的高度特异性的分子指纹图谱，可以区分不同菌株、得到抗生素作用的特征以及鉴定耐药性菌株，如仅需35 min就可以从尿道感染中识别病原体，在3.5 h内得到菌株抗生素耐药性/敏感性的信息等[41]，拉曼光谱快速、准确检测的突出优越性，在致病菌检测研究中已经占据十分重要的位置，具有广阔前景. 拉曼光谱与显微镜结合后所具有的空间分辨率使其可以对单个细菌的细胞进行分析，在阐明细菌对抗菌药物的耐药性的分子机制方面具有巨大的应用潜力，可跟踪单细菌细胞的拉曼信号，有助于揭示细菌生理代谢状态的改变，快速获取耐药性特征及有效预测耐药趋势，表征药物- 靶标反应，包括药物的吸收、外排、动力学变化以及药物靶点(DNA/蛋白质/细胞壁合成)的活性等，从而有效预测微生物耐药性的发展趋势[42]，为实现临床快速诊断致病菌和制定精准化的抗生素治疗方案提供有力的参考依据. 仪器制造工艺也正逐渐使拉曼光谱检测设备发展得更加小巧便携，为实现现场、快速检测提供了巨大的发展空间. 随着纳米材料技术的发展，增强基底的功能化改良与制备成为了新的研究热点. 目前，尽管利用拉曼技术进行细菌检测取得了一定的研究进展，但是由于目前尚缺乏标准的细菌拉曼谱库，不同课题组间的实验结果尚需要相互比对验证，这些困难的克服，将有助于推动拉曼光谱技术在临床检测分析上的真正实际应用，这也是众望所归之处.