苏姜猪组织中SIRT4蛋白表达分布分析

王洁,黄欣爱，2,王利红*

(1. 江苏农牧科技职业学院， 江苏 泰州 225300;2. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

SIRT4是沉默调节蛋白(sirtuin，sirt)家族中的一员，其在动物机体组织中的分布较为广泛，具有NAD+依赖的蛋白脂酰胺酶、ADP-核糖体转移酶和赖氨酸激酶的活性。在细胞生存、衰老和代谢等生物过程中，SIRT4通过谷氨酸脱氢酶(GDH)ADP核糖基化，限制GDH活性，影响谷氨酸代谢和细胞能量代谢，减少氨基酸刺激的胰岛素颗粒分泌。此外，SIRT4还具有抑制丙酮酸脱氢酶活性，继而影响脂肪酸氧化的功能[1-4]。在疾病防治方面，SIRT4具有调控低氧诱导的心肌凋亡，降低慢性阻塞性肺病的发病率，抑制肿瘤形成和增殖等功能[3]。桂林生[5]对秦川肉牛SIRT4基因SNPs及其与生长性状和肉质性状进行了关联分析，在3′UTR区域检测到g.16195C>A和g.16247A>G的 2个突变位点，g.16195C>A位点存在2种基因型，g.16247A>G 位点存在3种基因型，g.16247A>G以及 H4H3组合单倍型均与部分秦川肉牛生长发育和肉质性状显著关联，表明SIRT4可以作为候选基因应用于秦川肉牛改良育种工作中。Jin等[6]对通城猪SIRT家族基因序列进行了检测分析，在脑、心脏、肾脏、肺脏、胃、肠、腹脂、肌肉等组织中检测到SIRT4 mRNA的表达。然而，截至目前，尚未见SIRT4蛋白在猪不同脏器组织中表达定位的研究。本研究以苏姜猪为试验对象，通过免疫组织化学和ELISA检测方法分析不同脏器组织中SIRT4蛋白的表达与定位，为深入研究SIRT4蛋白在猪各组织中的功能，进而为苏姜猪优质性状的持续选育与提高提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及主要试剂

试验动物：来自江苏姜曲海种猪场。选取健康无病、系谱清楚、体重(25±0.65) kg左右的苏姜猪公猪(去势)和母猪各3头，饲喂4个月，试验猪的饲养管理方式和防疫措施均一致。

主要试剂：一抗SIRT4抗体(ab231137)、二抗羊抗兔(ab6721)均为英国ABCAM公司产品；SIRT4猪ELISA检测试剂盒(Angle Gene, ANG-E31372P)购自南京奥青生物技术有限公司。

1.2 样品采集

试验猪饲喂4个月后屠宰，屠宰后立即采集猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大肠、小肠等脏器组织和心肌、背最长肌、腿肌等肌肉组织。分别取上述各组织样品，修整成约2 cm×2 cm的组织块，置于甲醛溶液中固定，用于免疫组织化学检测。另分别取每种组织样品，并分成3份(用于重复试验)，分装在Eppendorf(EP)管中，置于液氮中，用于后续试验的ELISA检测。

1.3 免疫组织化学检测

将各组织样石蜡切片经脱蜡和水化处理后，用Tris-EDTA(pH=9)作为抗原修复液，微波高温加热进行热修复，自然冷却至室温，用TBS洗涤3次后，3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温中孵育30 min，用TBS缓冲液(pH 7.4)浸泡后洗涤3次，以5%胎牛血清(BSA)均匀覆盖组织，37 ℃血清封闭40 min，弃掉封闭液，使用5%goat-3%BSA-PBST稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，取出切片室温复温1 h，用PBST浸泡5 min，清洗后加入酶标二抗，室温孵育1 h；二氨基联苯胺(DAB)显色液显色，以苏木精复染细胞核后，梯度酒精脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察染色结果。

1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)

将组织样用pH 7.0～7.2，0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液洗净后，取约1.0 g 组织块移至10 mL EP管中，加入适量磷酸盐缓冲溶液和蛋白酶抑制剂PMSF，匀浆3次，13 000 r/min离心5 min，取上清，按照SIRT4 ELISA检测试剂盒说明书操作，最后在450 nm波长下依序测量各孔的吸光度(OD 值)。

1.5 数据分析

试验数据用“平均数±标准差”表示，用SPSS 19.0单因素方差分析(ANOVA)进行差异显著性检验，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 SIRT4蛋白在苏姜猪组织中的表达定位分布

通过免疫组织化学方法对苏姜猪肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃、大肠、小肠等脏器以及心肌、背最长肌和腿肌组织中SRIT4蛋白表达分布进行检测，结果见图1。SIRT4蛋白免疫阳性颗粒主要分布于肺脏组织的肺泡上皮层和支气管的黏膜层细胞(图1A)，肝脏组织的肝细胞(图1B)，脾脏组织的红髓区细胞(图1C)，肾脏组织的近曲小管和远曲小管细胞(图1D)，胃(图1H)、大肠(图1I)和小肠(图1J)组织的腺细胞，心肌(图1E)、背最长肌(图1F)和腿肌(图1G)组织的肌细胞质中。

A. 肺脏(100×)；B. 肝脏(200×)；C. 脾脏(100×)；D. 肾脏(200×)；E. 心肌(200×)；F. 背最长肌(200×)；G. 腿肌(200×)；H. 胃(100×)；I. 大肠(100×)；J. 小肠(100×)

2.2 苏姜猪组织中SIRT4蛋白表达水平

通过ELISA方法检测SIRT4蛋白在苏姜猪肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大肠、小肠的脏器组织，以及心肌、背最长肌、腿肌的肌肉组织中的表达水平，试验结果见表1。统计分析公猪(去势)和母猪各组织中SIRT4蛋白的表达量，分析结果显示，公猪(去势)胃和小肠组织中的表达量相对较高，显著高于其他组织(P<0.05)，其次是大肠组织中的表达量(P<0.05)；母猪组织中，大肠和小肠组织中的表达量相对最高，显著高于其他组织(P<0.05)。用猪组织中SIRT4蛋白表达量从高到低依次为大肠、小肠、肾脏、肝脏、背最长肌、腿肌、心肌、脾脏、胃、肺脏组织。

SIRT4蛋白除了在公猪(去势)肾脏和大肠组织中表达量稍低于母猪外，其他组织中公猪SIRT4蛋白的表达量均高于母猪，在肝脏、脾脏、肺脏、胃、小肠、心肌、背最长肌、腿肌组织中SIRT4蛋白的表达量分别是母猪组织中表达量的1.02、1.24、1.48、1.80、1.04、1.48、1.09、1.27倍。统计分析公母苏姜猪同一组织样中SIRT4蛋白表达量，苏姜公猪(去势)肺脏、腿肌、胃和脾脏组织中SIRT4蛋白的表达量显著高于母猪相应组织中表达量(P<0.05)。

表1 苏姜猪组织样中SIRT4蛋白表达量 pg/mL

3 讨论

SIRT4蛋白作为sirtuins家族中的一员，在调控动物机体脂肪酸的氧化和能量代谢过程中发挥者至关重要的作用[7]。SIRT4是一种NAD+依赖的ADP核糖基化酶，抑制SIRT4基因表达可以在线粒体和核仁中刺激逆行信号的发生，其中涉及腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase， AMPK)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase)以及线粒体呼吸机能相关的因子，表明SIRT4基因在维持 ATP 的平衡中发挥关键的作用[8]。在猪的脑、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、胃、肠、腹脂、肌肉等组织中已检测到SIRT4 mRNA的表达[6]。本研究通过ELISA和免疫组织化学方法在苏姜猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大肠、小肠等脏器组织，以及心肌、背最长肌、腿肌等肌肉组织中，均检测到SIRT4蛋白的表达，进一步表明SIRT4基因在猪组织中的表达具有广泛性。本试验的研究结果也验证了Jin等[6]有关SIRT4 mRNA基因在猪脏器组织中的表达的研究结果。

通过免疫组织化学检测方法，在苏姜猪的心肌、背最长肌、腿肌组织的肌细胞中检测到明显的SIRT4免疫阳性颗粒，经ELISA测定，结果也显示SIRT4蛋白在肌肉组织中表达量相对较高，表明SIRT4在肌肉组织收缩运动过程中发挥着重要的作用。Liu等[9]研究表明，心脏中SIRT4还能够影响前体半胱天冬酶向半胱天冬酶转化的比率，进而发挥调控低氧诱导心肌凋亡的作用[9]。本试验除肌肉组织外，在消化系统如胃、大肠、小肠的腺细胞中也检测到明显的SIRT4蛋白免疫阳性颗粒，表明SIRT4与腺细胞的功能密切相关。ELISA测定结果也显示，消化系统中SIRT4蛋白表达量相对高于其他组织，表明SIRT4蛋白参与苏姜猪消化系统的物质消化代谢过程。

肾脏的主要功能包括维持机体内水、电解质和酸碱平衡；产生多种激素，参与调节血压、造血等生理活动；参与维生素D的活化；通过生成尿液，排泄体内的代谢产物等。通过免疫组织化学方法，在苏姜猪肾脏组织的近曲小管和远曲小管细胞中检测到丰富的SIRT4免疫阳性颗粒，但在肾小球中分布极少，表明SIRT4在原尿的重吸收和离子的交换过程中具有重要作用。肝脏组织中SIRT4与过氧化物酶体增殖物激活受体-α(hepatic peroxisome proliferator activated receptor,PPAR-α)表达呈负相关，敲除SIRT4基因小鼠的肝脏中PPAR-α表达量升高，脂肪酸分解速度受到抑制，而过表达SIRT4则结果相反[10]。肺组织中，SIRT4的表达与部分炎症因子的活性存在关联，如Chen等[11]在香烟烟雾提取物处理过的人肺微血管内皮细胞中，发现 SIRT4 表达量明显下降，在这些细胞中过表达SIRT4 后，能够减弱血管细胞黏附分子1和选择蛋白 E-selectin 的诱导，同时抑制 NF-κB、IL-1β和 TNF-α等炎症因子的活性，说明SIRT4可能具有减缓慢性阻塞性肺病的发生率[11]。本试验经免疫组织化学方法，在苏姜猪肝细胞和肺组织肺泡上皮层和支气管的黏膜层细胞中均检测到丰富的SIRT4免疫阳性颗粒，表明SIRT4在苏姜猪的肝功能和肺组织的气体交换功能中具有重要的作用。

对比公(去势)母苏姜猪各组织中SIRT4蛋白表达量，结果显示，除肾脏和大肠组织的表达量稍有不同外，公猪组织中SIRT4的表达量均相对高于母猪，特别是在胃、肺脏、脾脏和腿肌中的表达量显著高于母猪。这表明，SIRT4在动物组织中的表达水平可能与性别、不同组织的物质和能量代谢强弱程度有关。

4 结论

通过ELISA和免疫组织化学检测，SIRT4在苏姜猪组织中的表达具有广泛性，且SIRT4主要定位于肌肉组织的肌细胞、肺组织肺泡上皮和支气管黏膜层细胞、肝脏肝细胞、脾脏红髓区细胞、肾脏近曲小管和远曲小管细胞、胃和肠组织腺细胞。不同组织之间SIRT4表达量存在一定差异，公猪(去势)多数组织中SIRT4表达量相对高于母猪，特别是在物质和能量代谢旺盛的组织(如小肠、大肠、肝脏、肾脏)中有相对较高的表达量，表明SIRT4在苏姜猪各脏器的物质能量代谢过程中具有重要的作用。