远志皂苷元对脂多糖诱发神经细胞炎症损伤的保护作用

皮 婷，梁月琴，欧雯励蓉，朱 晗，陶彦林，金醒昉*

(1.昆明医科大学附属延安医院，昆明 650051； 2.中南大学湘雅医学院，长沙 410013； 3.上海中医药大学中药研究所，上海 201203)

据全国肿瘤登记中心，最新的肿瘤登记年报显示中国新发恶性肿瘤发病约392.9万人，死亡约233.8万人。平均每天超过1万人被确认为癌症，每分钟有7.5个人被确证为癌症。随着恶性肿瘤发病率的增高，化疗药物所扮演的角色也越来越重要，同时这些药物所引起的近期或远期的不良反应也日渐受到关注。最早是在接受化疗后的乳腺癌患者中发现，很多幸存者都出现记忆力下降等认知功能障碍，被称为“化疗脑”(chemo-brain)。近几年体内外大量研究表明，长期使用化疗药物后可导致患者出现“化疗脑”：即化疗相关性认知功能障碍，是癌症患者在化疗后出现的记忆力、学习力、注意力、推理能力、执行功能、信息加工速度和视觉空间功能等认知功能的损害[1-4]。而有研究认为“化疗脑”主要是由于少量化疗药物或炎症反应细胞因子等透过血脑屏障，多因素作用后，造成中枢神经毒性，导致神经元损伤甚至神经再生障碍[5-6]。由此可知，炎症因子在“化疗脑”的发生发展中起到了举足轻重的作用，且炎症细胞因子级联反应所引起的神经损伤是“化疗脑”发生的关键因素。

学者们发现神经营养因子或神经保护因子，如神经生长因子(neurogrowthfactor, NGF)[7-8]、胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF1)[9]、促红细胞生成素[10-11]、白血病抑制因子(leukaemia factor, LIF)[12]等，可一定程度的减缓神经病变，改善“化疗脑”。然而，由于它们的分子量大难以透过血脑屏障、稳定性差、或对人体有害副作用等等，限制了其临床应用。

远志为常用药用植物，《神农本草经》记载：主咳逆伤中，补不足，除邪气，利九窍，益智慧，耳目聪明，不忘，强志倍力。富含皂苷类、寡聚糖类、口山酮类化合物，具有提高记忆、改善认知等药理作用[13-15]。远志皂苷元为远志皂苷水解产物，为齐墩果烷型三萜，我们前期研究发现远志皂苷元可促进皮质神经元存活，促进神经元突起生长，具有类似神经营养因子作用[16-18]。但远志皂苷元对神经细胞炎症损伤方面的影响研究较少。

为了探讨远志皂苷元对神经细胞的炎症损伤是否具有保护作用，本文以脂多糖作用小神经胶质细胞BV2诱导神经炎症损伤模型，通过观察炎症因子及炎症相关蛋白的表达，来探究具有神经营养作用的小分子中药单体—远志皂苷元对神经细胞炎症损伤的保护作用，为进一步研究“化疗脑”的防治提供新思路及新方向。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

本研究中涉及细胞人多巴胺能神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y由中科院细胞库提供；小鼠小胶质细胞BV2购自ATCC。

1.2 主要试剂与仪器

远志皂苷元，购自北京索莱宝科技有限公司，含量>99.0%，实验时用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)配置成相应浓度, 4℃保存； 地塞米松(dexamethasone，Dex)(M0606AS)购自大连美仑生物技术有限公司；胰蛋白酶(美国Amresco公司); DMEM (美国Gibco公司); 胎牛血清(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司); 磺胺(S9251)，盐酸萘乙二胺(N9125)均购自美国Sigma公司；COX-2引物(mus-cox2-F:CTGAGTGGGGT GATGAGCAA;mus-cox2-R:GAGGCAATGCGGT TCTGATAC)购自上海捷瑞生物工程有限公司; 兔抗人COX-2单克隆抗体(12282)购自美国CST公司; GAPDH(GAPDH-F-5’ATGTGTCCGTCGTGGATC TGA3’;GAPDH-R-5’ATGCCTGCTTCACCACCTTCT3’)购自上海捷瑞生物工程有限公司；其余试剂均为国产分析纯。12 孔板、96 孔板(美国Corning 公司产品)；SW-CJ-1F型超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；培养箱(英国GalaxyS公司)； 倒置显微镜(日本lympus公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 神经细胞的制备和培养

小胶质细胞BV2细胞用DMEM/FBS+1% PS的培养液，在5% CO2、37℃湿饱和条件下培养。细胞生长至80% 融合度时，以0.25%的胰酶消化后按1瓶传至3瓶进行传代，取其对数生长期细胞进行实验。

人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y用DMEM/FBS + 1% PS的培养液，在5% CO2、37℃湿饱和条件下培养。细胞生长至80%融合度时，以0.25%的胰酶消化后按1瓶传至4瓶进行传代，取其对数生长期细胞进行实验。

1.3.2 炎症介质NO浓度检测

调整BV2细胞浓度为每毫升1.5×106个，种于96孔板中过夜，预给药远志皂苷元后2 h，加入LPS(终浓度200 ng/mL)，分为：空白对照组，LPS组，地塞米松组及远志皂苷元各浓度组。继续培养22 h后，利用Griess Reagent法检测炎症介质NO浓度。于超净台内分别每孔吸80 μL上清液到新的96孔板中，同时制作NaNO2标准曲线(200、100、50、25、12.5、0 μmol/L)，每个浓度设置2个副孔，避光下加入80 μL预先配置好的Greiss试剂(A液∶B液=1∶1)，混匀后于培养箱中孵育15 min，利用酶标仪在540 nm处测定吸光度值。绘制NaNO2标准曲线，将吸光度值带入标准曲线中计算NO含量。

调整SH-SY5Y细胞浓度为每毫升1.6×106个，种于96孔板中过夜，加入远志皂苷元作用于LPS诱发BV2细胞炎症的上清刺激细胞，培养24 h。然后利用通过上述 Griess Reagent 法检测NO 浓度。

1.3.3 兔抗人环氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX2)表达水平检测

调整BV2细胞浓度为每毫升1.5×106个/mL，种于12孔板中过夜。分为：空白对照组，LPS组，地塞米松组及远志皂苷元(2 μmol/L、2.5 μmol/L、3 μmol/L)低、中、高剂量组，预给药低、中、高剂量远志皂苷元后2 h，加入LPS(终浓度终浓度200 ng/mL)，再继续培养22 h后，1000 r/min离心5 min，收集细胞，QPCR法检测COX-2 mRNA(mus-cox2-F：CTGAGTGGGGTGATGAGCAA；mus-cox2-R：GAGGCAATGCGGTTCTGATAC)表达水平，Western blot法检测COX-2蛋白表达水平。

1.3.4 QPCR法检测COX-2 mRNA表达

实验分组如前所述，各组细胞均于药物干预 24 h 后提取RNA。按试剂盒说明书进行总RNA的提取、逆转录成cDNA，再进行 PCR 扩增。PCR反应体系总体积为18 μL。反应条件如下：95℃预变性5 min， 继之95℃变性10 s，60℃退火30 s，95℃ 延15 s，共42个循环。计算结果用GAPDH标化目的基因的相对表达，通过2-ΔΔCt定量目的基因。

1.3.5 Western blot 印迹法检测COX-2蛋白表达

实验分组如前所述。各组细胞均于药物干预 24 h 后提取细胞蛋白。上样前先将制备好的蛋白样品95℃煮5 min，冷却后瞬时离心，待用。取变性后的各组细胞蛋白等量上样到SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳结束后将胶上的蛋白转移到PVDF膜，100 V转模2 h后用5%脱脂奶粉在室温下封闭1.5 h，孵育相应的一抗4℃过夜，次日用PBST室温下洗涤3次，每次10 min。然后据一抗的抗性选择相同抗性的二抗(稀释比例为1∶5000)进行室温下孵育1 h，用PBST洗涤3次，每次10 min。再据底物试剂盒要求显影、拍照，并保存图像。运用TanonImage软件进行目的蛋白灰度分析。

1.3.6 细胞活力检测

调整SH-SY5Y细胞浓度为每毫升1.6×106个，种于96孔板中过夜。分为：空白对照组(不做任何处理)，对照组(除远志皂苷元外，其余均加入)，LPS组，地塞米松组及远志皂苷元低、中、高剂量组。SH-SY5Y细胞贴壁后，弃上清换用LPS诱发小胶质细胞BV2炎症的上清1 mL，并加入远志皂苷元(2 μmol/L、2.5 μmol/L、3 μmol/L)继续培养24 h后，加入 CCK-8孵育 0.5 h，采用波长450 nm 测定吸光值。

注：与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图1 不同浓度远志皂苷元对LPS诱导的BV2细胞NO释放量的影响Note. Compared with the LPS group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Table 1 Effects of different concentrations of senegenin on the release of NO in LPS-induced BV2 cells

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度的远志皂苷元对LPS诱发小胶质细胞BV2产生NO的影响

因前期研究发现[16-18]2 μmol/L远志皂苷元具有较好的神经营养作用，故在BV2细胞上摸索远志皂苷元的抗炎有效浓度时，设计了1、2、4、8 μmol/L，5、25、50、100 μmol/L两个梯度。如图1A-C所示，图1A是从1、2、4、8 μmol/L的远志皂苷元，结果显示1、2 μmol/L两个浓度的远志皂苷元有抗炎作用(P< 0.01或P< 0.05)；图1B是从5、25、50、100 μmol/L的远志皂苷元，结果显示均无抗炎作用，还具有促炎作用，且呈浓度依赖性；根据以上结果缩窄远志皂苷元的浓度，图1C是1.5、2、2.5、3、3.5 μmol/L 的远志皂苷元，结果显示这些浓度下的远志皂苷元均有抗炎作用(P<0.01或P<0.05或P<0.001)，且以2 μmol/L的远志皂苷元抗炎作用最为明显。

2.2 远志皂苷元对LPS诱导的BV2细胞COX-2 mRNA表达的影响

根据以上结果选取2、2.5、3 μmol/L(低、中、高)剂量远志皂苷元作用的细胞进行COX-2 mRNA表达的检测，结果如图2所示，LPS作用后的BV2细胞COX-2 mRNA显著升高(P<0.001)，阳性药地塞米松组和LPS组相比显著降低(P<0.001)，2、2.5 μmol/L的远志皂苷元组和LPS组相比也显著降低(P<0.001)。

2.3 远志皂苷元对LPS诱导的BV2细胞COX-2蛋白表达的影响

Western blot 检测低、中、高剂量组远志皂苷元COX-2 蛋白的表达情况。结果如图3所示，LPS作用后的BV2细胞中COX-2 蛋白表达显著升高(P< 0.001)，与LPS组相比，阳性药地塞米松组COX-2 蛋白表达显著降低(P<0.001)，虽2 μmol/L远志皂苷元组COX-2 蛋白表达量高于阳性对照组，但相比LPS组也有较明显的降低(P< 0.05)。

2.4 远志皂苷元对SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后的细胞活力影响

该部分实验主要是研究远志皂苷元对SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后的炎症影响，需加入前部分实验中LPS诱导BV2细胞炎症后的上清，所以该部分实验分了两个实验对照 (Ctrl) 组，一个对照组不加BV2细胞炎症上清，另一个对照加入该上清。这样更好的排除了其他因素对结果的影响，增加该实验结果的说服力，确保该部分实验中远志皂苷元为主要实验变量，明确远志皂苷元在该部分实验中的作用。

如图4所示，SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后，LPS刺激BV2上清组的细胞活力和对照组相比显著下降(P<0.05)，给2.5、3 μmol/L 远志皂苷元BV2上清可以保护SH-SY5Y细胞活力免遭LPS的影响(P<0.05或P<0.01)。

注：与LPS组比较， **P<0.01，***P<0.001。图2 远志皂苷元对LPS诱导的BV2细胞COX-2 mRNA 表达水平的影响Note. Compared with the LPS group, **P<0.01，***P<0.001.Table 2 Effect of senegenin on the expression level of coX-2 mRNA in LPS-induced BV2 cells

注：A: WB条带；B：灰度值比较。与LPS组比较， *P<0.01，****P<0.001。图3 远志皂苷元对LPS诱导的BV2细胞COX-2 蛋白表达水平的影响Note. A, WB strip. B, Gray value comparison. Compared with the LPS group, *P<0.01，****P<0.001.Table 3 Effect of senegenin on the expression level of COX-2 protein in LPS-induced BV2 cells

注：与LPS组比较，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。图4 远志皂苷元对SH-SY5Y接受BV2炎症 上清刺激后细胞活力的影响Note. Compared with the LPS group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001.Table 4 Effects of senegenin on cell viability of SH-SY5Y after BV2 supernatant stimulation

注：与LPS组比较，***P<0.001。图5 远志皂苷元对SH-SY5Y接受BV2炎症上清 刺激后NO释放量的影响Note. Compared with the LPS group, ***P<0.001.Table 5 Effects of senegenin on the release of NO after SH-SY5Y received BV2 supernatant stimulation

2.5 远志皂苷元对SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后的细胞产生NO影响

如图5所示，实验分组与上述分组情况一样。SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后，LPS刺激BV2上清组的SH-SY5Y细胞分泌NO和空白对照组相比显著上升(P<0.001)；相比LPS的BV2上清组，2、2.5、3 μmol/L 远志皂苷元BV2上清组均可较为显著地降低SH-SY5Y细胞NO释放量(P<0.001)。

3 讨论

目前，因化疗药物所产生的不良反应，如：周围神经病变等神经毒性效应，在很大程度上影响了其临床使用。而对于某些高效抗肿瘤药，如铂类似物或紫杉烷家族成员而言尤为严重，由于这些药物一般需依赖剂量或治疗方案来发挥治疗效果。这种神经毒性效应将严重影响患者的生活质量[19]，即使在化疗停止很长一段时间仍存在。尽管可见一些神经再生，但其再生速度缓慢，且在很多情况下，神经病变的逆转也并不完全，甚至还可能影响生活质量及正常功能长达多年。

“化疗脑”作为一种神经系统的疾病，主要是癌症患者化疗后的认知功能的受损[20]，但其诱因较为复杂，发生机制仍未明确。有猜测“化疗脑”是异常大脑重构、延缓的损伤修复系列活动后，为神经-内分泌-免疫学改变所导致的结果[21]。有研究报道化疗可引起促炎细胞因子水平的升高，引起炎症反应，可能是周围组织中产生的炎症因子，穿过血脑屏障影响大脑功能，也可能是化疗后直接导致大脑内部产生炎症反应，这点尚未明确[22-23]。但有研究明确炎症因子与化疗后认知障碍的发生密切相关，且化疗后大量炎症因子的产生又促进了患者“化疗脑”的发展[24]。体外实验中发现5-FU等可显著地促进促炎因子的产生[25]。有学者发现在恶性肿瘤如乳腺癌、霍奇金病等患者体内炎症因子水平显著升高[26-27]、神经元凋亡，猜测这一改变与“化疗脑”的发生密切相关。可肯定的是炎症反应及其相关细胞因子可致神经元受损并降低海马神经元再生功能，导致认知障碍[28]。因此，抑制炎症因子的释放，可能对改善神经损伤及延缓“化疗脑”具有重要的意义。

本研究中不同浓度远志皂苷元对LPS诱导的BV2细胞产生NO的影响的浓度筛选结果显示， 5、25、50、100 μmol/L的远志皂苷元均无抗炎症反应作用，且与LPS组相比，5、25、50、100 μmol/L的远志皂苷元反而有明显地促炎作用，以100 μmol/L效果最显著(P<0.001)；而1.5、2、2.5、3、3.5 μmol/L的远志皂苷元均可显著地降低NO释放，尤以2 μmol/L远志皂苷元降低作用较为显著(P<0.001)。表明低浓度远志皂苷元可降低NO释放，可能具有抗炎症作用。环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是花生四烯酸代谢前列腺素过程的主要限速酶，COX同工酶一COX-2是一种重要的炎症介质，炎症反应伴随 COX-2表达增加与许多神经疾病的病理过程中神经元的变性和凋亡有关。Yang等[29]发现经甲氨蝶呤治疗乳腺癌小鼠后其海马功能障碍，与其前列腺素合成酶、COX-2 及NO 合成酶iNOS表达上调密切相关。在认知障碍患者或动物模型的研究中发现，氟西汀可通过提高海马神经的再生及可塑性，增加脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)的表达，来改善其认知功能[30-31]。仝太山等[32]研究发现乳腺癌患者化疗后的认知功能障碍与其自身BDNF水平下降具有显著相关。茅东升等[33]报道NGF可减少 LPS 引起的 PC12 细胞的坏死和凋亡，对LPS损伤具有保护作用。还有研究报道NGF可抑制LPS诱导的成骨细胞产生NO，同时抑制COX-2 mRNA的表达，具有抗炎作用[34]。前期研究中，我们发现远志皂苷元可促进神经突起生长、促进细胞存活，具有类似神经营养因子作用，且还发现远志皂苷元可提高BDNF mRNA表达水平[16-18]。本研究选取2、2.5、3 μmol/L的远志皂苷元作用于LPS诱导的BV2细胞，观察炎症因子COX-2的表达情况。结果显示，远志皂苷元可不同程度地抑制炎症相关蛋白 COX-2的表达，以2 μmol/L远志皂苷元抑制作用较为明显(P<0.05)(图2、3)。表明远志皂苷元可抑制神经炎症因子释放，具有改善神经损伤的作用。

本研究还观察了远志皂苷元对SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后是否具有保护作用，发现远志皂苷元不仅可促进BV2炎症上清刺激后的SH-SY5Y细胞的存活，且呈剂量依赖性；还可显著地降低SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后NO的释放，这表明远志皂苷元可能具有降低炎症反应的作用，具有神经保护作用。

综上所述，远志皂苷元不仅可降低LPS诱导后炎症介质NO的释放，抑制炎症介质COX-2的表达；也能促进SH-SY5Y接受BV2炎症上清刺激后细胞存活的同时抑制NO的释放量，表明远志皂苷元具有类似神经营养因子作用，改善神经炎症病变，具有潜在的缓解“化疗脑”的作用。在下一步实验中，将建立不同的细胞及动物模型，如化疗药物损伤模型等，进一步观察远志皂苷元的神经保护作用，为“化疗脑”的治疗提供新方向、新思路。