基于整合药理学研究麝香乌龙丸治疗类风湿性关节炎的分子机制

王志文，侯淋飞，张凯淇

(1.华北理工大学附属医院，河北 唐山；2.华北理工大学，河北 唐山)

0 引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以持续性滑膜炎、全身炎症和自身免疫反应为主要特征的系统性疾病，中医角度对疾病进行内、外因分析认为，RA是由于正气亏虚引起外邪侵袭，归属“痹证”的范畴。该疾病在妇女和老年人中最为典型，可引起软骨、骨骼损伤和残疾，严重影响患者生活质量[1]。对RA治疗策略，首先是定期评估患者的疾病活动，并根据评估情况制定或修正治疗方案。常用的抗风湿病药物(anti-rheumatic drugs，DMARDs)包括生物和非生物型DMARDs，此外还有非甾体抗炎药、糖皮质激素等，虽然大多数治疗方案在临床上证实具有显著的疗效，但许多人仍然对目前的治疗没有反应[2]。中医学的整体调节、多环节、多渠道的效果，对该疾病的治疗具有优势[3,4]，因此，深入研究疾病的发生机制和用药靶点，挖掘有效的中成药、药物成分和核心化合物，将为RA的临床诊疗提供新的思路。

王志文教授参阅了古书宋朝许叔微的《普济本事方》中的记载，将“麝香圆”方剂应用于对RA的治疗，确定了“麝香圆”方剂治疗RA的药物组成、剂量配比等指标，命名为麝香乌龙丸。近年来，针对麝香乌龙丸治疗RA的机制，课题组进行了一些列实验研究和临床探索和考证。发现，麝香乌龙丸可通过调节炎症因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素 -1(interleukin-1，IL-1)、白细胞介素 -6(interleukin-6，IL-6)或微小 RNA(microRNA)等，影响成骨细胞和破骨细胞的活性，进而缓解RA[3-8]。由于麝香乌龙丸成分多与作用方式复杂，因此本研究应用网络药理学的方法对RA的分子机制和麝香乌龙丸治疗RA的分子机制进行系统和全面的挖掘，这将为RA的发病机制和治疗靶点提供有价值的参考，也为深入研究麝香乌龙丸治疗RA的作用提供更深层次、更多元的信息。

1 资料与方法

1.1 麝香乌龙丸活性化合物的筛选

大麝香乌龙丸的主要化合物为麝香、川乌、黑豆、全蝎、地龙，检索化合物平台如下：

(1)中药系统药理学[9](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)，设置筛选参数：口服生物利用度(OB)≥30%；类药性(DL)≥0.18，获得化合物。

(2)中药综合数据库(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)(http://119.3.41.228:8000/tcmid)获得化合物。

共检索到化合物59个，检索到的化合物通过PubChem数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载sfd格式的化合物的2维结构图，并绘制韦恩图。

1.2 麝香乌龙丸活性化合物靶点的收集

将保存的sfd格式的化合物的2D结构图导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测化合物作用靶点。

1.3 麝香乌龙丸化合物靶点网络的构建

将麝香乌龙丸的化合物靶点信息导入Cytoscape 3.7.2软件，以化合物和靶点为节点，两者关系为边，绘制化合物-靶点互作网络。

1.4 AR疾病靶点的预测

选择3个疾病靶点数据库GeneCard数据库(https://www.genecards.org/)、OMIM 数据库 (https://www.omim.org/)和DisGenet[10]数据库(https://www.uniprot.org/database/DB-0218)预测AR的靶点，输入关键词“rheumatoid arthritis”进行检索，靶点去重后，构建AR的靶点库，绘制疾病靶点韦恩图。

1.5 麝香乌龙丸化合物靶点-AR疾病靶点互作网络

疾病靶点和药物靶点取交集后得到40个映射靶点，通过String数据库(https://string-db.org/)构建蛋白相互作用网络。

1.6 点本体(gene ontology,GO)功能与KEGG通路富集分析

选择DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行GO功能与KEGG通路富集分析。校正筛选的药物-疾病交集靶点名称，输入靶点和物种，以P＜0.05设定阈值进行检索，对分析结果通过可视化网站微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)导出结果图。

2 结果

2.1 麝香乌龙丸化合物筛选

基于TCMSP数据库，查找麝香乌龙丸主要成分川乌、黑豆的活性化合物，筛选OB≥30%，DL≥0.18的化合物，结果显示，川乌包含8种化合物，黑豆包含13种化合物。对于TCMSP数据库检索不到的成分麝香、地龙和全蝎采用TCMID数据库检索，结果显示麝香、地龙和全蝎分别包含25种、1种和11种化合物，将化合物通过PubChem数据库查询其2维结构，结果见图1，化合物成分的韦恩图见图1。

图1 麝香乌龙丸成分化合物韦恩图

2.2 麝香乌龙丸化合物靶点网络

通过Swiss Target Prediction数据库预测结果显示，除了地龙的一个化合物未找到靶点外，其他的四味中药化合物的靶点经过去重，共获得231个靶点，其中麝香、川乌、黑豆和全蝎分别有93、59、65和71个靶点，并包含重复靶点，和特有靶点，如图2。将中药、化合物和靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，获得麝香乌龙丸化合物靶点网络如图3所示，该图包含291个节点(中药4个黄色三角形、56化合物六边形、靶点231个菱形)，就389条边。

图2 麝香乌龙丸靶点韦恩图

2.3 AR相关蛋白质相互作用(protein-proteininteraction,PPI)网络

通过GeneCard数据库、OMIM数据库和DisGenet数据库共检索到与RA相关靶点1119个，其中9个靶点为三个网站的交集靶点，分别为溶质载体家族22(solute carrier family 22 member 4，SLC22A4)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受体22型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)、肽基精氨酸二亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PADI4)、核因子抑制因子 1(Nuclear factor kappa b inhibitor like 1，NFKBIL1)、巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)白细胞介素 6(interleukin 6，IL6)、白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)、II类组织相容性复合物激活剂(class II major histocompatibility complex transactivator，CIITA) 和CD244分子(见图4)。

2.4 麝香乌龙丸化合物靶点-AR疾病靶点互作网络和分析

将231个化合物相关靶点与1119个疾病相关靶点取交集，得到40个化合物疾病共同靶点，通过对这40个靶点进行PPI网络互作分析如图4，将化合物靶点-RA疾病靶点经生物过程(biologcalprocess，BP)分析显示，前10位靶点主要参与转录起始、毒性反应应答、细胞凋亡、第二信使的调节，分子功能(molecular function，MF)分析显示，靶点只要参与结合调节固醇类代谢、蛋白质二聚化、酶结合活性、DNA结合活性、RNA聚合酶结合活性、转录因子活性等调节，细胞组分(cellularcomponent，CC)分析发现，靶蛋白主要在线粒体膜外、细胞质、细胞膜、核浆等部位分布。KEGG分析结果显示，靶点主要为主要参与调控细胞凋亡、基因表达调控、细胞核受体-配体结合、内分泌调控、cAMP信号、脂肪细胞脂肪分解的调节等相关通路(见图5、图6)。

3 讨论

基础和临床研究证实，麝香乌龙丸方应用于临床抗类风湿关节炎的治疗具有良好的疗效[3-8]。复方中，麝香为君药，活血通络，止痛消肿；川乌为臣药，祛风散寒，除湿温经；全蝎、地龙为佐药，镇痉除痹，通络止痛，共同祛寒湿之邪外出；黑豆为使药，补肝益肾，健脾解毒。课题组针对麝香乌龙丸治疗类风湿关节炎的机制进行了多层次的研究和探讨，发现麝香乌龙丸可调节炎症、滑膜微血管等[7,8]，最近又发现，其通过调节外周血微RNA，发挥抑制类风湿关节炎的作用[3,4]。由于中药成分多，其作用靶点和通路复杂，因此本研究借助了生物信息学的手段和方法，分析了麝香乌龙丸治疗类风湿关节炎的潜在治疗靶点，以期进一步完善分子机制。本研究通过TCMSP、TCMID等化合物分析平台筛选，得到了59个化合物；Swiss Target Prediction、GeneCard、OMIM、和 DisGenet等靶点预测平台，结合生物信息分析平台找到了40个麝香乌龙丸的化合物-RA疾病映射靶点，通过分析发现，麝香乌龙丸对凋亡的调控作用最为显著，其次参与第二信使cAMP信号、和DNA及RNA的生物合成过程。

图3 麝香乌龙丸靶点的PPI网络

细胞因子、趋化因子和蛋白酶的产生，激活成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)，同时在RA滑膜区域，FLS细胞的死亡受体-线粒体凋亡途径抑制，使FLS不受控制的生长，因此，FLS细胞凋亡不足被认为是RA的重要特征，在RA发展中发挥关键作用[11,12]。在RA患者和胶原诱导关节炎大鼠(collagen-induced arthritic rats)模型中研究证实，促进细胞凋亡是抑制RA的一种潜在的治疗手段[13,14]。本研究中，我们发现，麝香乌龙丸全蝎中的有效成分可以抑制抗凋亡蛋白BCL-2，并与炎症因子IL-6有关，另外，麝香中的有效成分参与对肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、cAMP和IL-10的调控，TNF-α是诱导FLS活化和RA的重要细胞因子，有研究报道，RA患者给予磷酸二酯酶抑制剂维持cAMP的水平，可减少促炎细胞因子TNF-α、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)和IL-17的产生，同时促进抗炎因子IL-10的产生，因此，对cAMP的调控可通过调节免疫活性，抑制RA的发生[15,16]。值得注意的是，在麝香乌龙丸-RA映射靶点的KEGG 通路富集分析结果中发现，大量富集靶点参与DNA的的表达调控，如影响DNA结合活性、RNA聚合酶结合活性、转录因子活性等调节等。课题组前期已证实部分miRNA参与麝香乌龙丸抑制RA的调控，包括miRNA-181a、miRNA-16及miRNA-18a等[3]。它们可通过调节炎症反应、免疫反应，影响关节和软骨的重塑/损伤平衡，抑制RA。

图4 麝香乌龙丸-RA映射靶点韦恩图和PPI网络

图6 麝香乌龙丸-RA映射靶点KEGG通路富集分析

总之本研究的结果既验证了课题组以往的研究，又补充和完善了麝香乌龙丸抗RA的新的靶点信息。然而，本研究仅通过生物信息学手段对麝香乌龙丸的抗RA机制进行初步预测，因此存在局限性，后续仍需要通过体内外实验充分验证该预测信息，并通过循证医学等分析方法进一步证实麝香乌龙丸在抗RA中的作用。