丁氏妇科补肾养血保胎方对流产大鼠相关激素及子宫肌的影响

李琼，丁丽仙*，犹昌会，熊玉瑶

(1.贵州中医药大学第一附属医院，贵州 贵阳；2.贵州瓮安县中医院，贵州 瓮安；3.贵州中医药大学，贵州 贵阳)

0 引言

先兆流产属于中医“胎漏、胎动不安、妊娠腹痛”的范畴，近年来，发生率逐年升高，并且发生的原因诸多，目前西医的治疗方法主要以补充黄体酮及HCG 为主，而中医药在治疗方面有着独特的优势[1]。丁氏妇科第十代传人、全国第六批老中医药专家学术经验继承指导老师丁丽仙教授多年来自拟丁氏妇科补肾养血保胎方治疗先兆流产，取得较好临床疗效，为探求该方的作用机理，本研究采用SD 大鼠肾虚流产模型，进一步探讨该方对相关激素及子宫肌收缩力的影响，结果报道如下。

1 材料

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠，其中雌鼠80 只，雄鼠40 只，3-4 月龄，体重(280±15)g，由湖南省长沙市天勤生物有限公司提供，许可证证号：SCXK(湘)2014-0011，在在贵州中医药大学动物研究所适应性喂养1 周，环境温度18℃-24℃，环境良好，进食自由。

1.2 药物与试剂

补肾养血保胎方由黄芪、党参、炒白术、川断、桑寄生、菟丝子、阿胶珠、白芍、甘草、仙鹤草等中药组成，饮片购于贵州省中医院，上述药物水煎、过滤、浓缩，瓶装标记，放置4-8℃冰箱冷藏备用。羟基脲：北京嘉林药业股份有限公司，批准文号：国药准字1H3080239。保胎灵：(国药准字Z22026139)生产企业：吉林省辽源亚东有限公司。米非司酮纯粉剂：广州市齐云生物技术有限公司，产品编号：C84-1587-1G，批号：MB1587。大鼠雌二醇(E2)ELISA 试剂盒(E-EL-0065c)、孕激素(Pg)ELISA 试剂盒(E-EL-0090c)、绒毛膜促性腺激素β 肽HCG ELISA 试剂盒(E-EL-R0386c)，试剂均来源于武汉伊莱生物科技有限公司。

1.3 仪器

肌张力换能器：量程：10g，淮北正华生物仪器设备有限公司；生物医学信号采集系统：MedLab-U/8C 北京众实迪创科技发展有限责任公司；计算机：校中心实验室设备科提供；电子天平：：FA1004N 电子分析天平；微型高速离心机：C2500-R-230V 美国Labnet；全自动酶标仪：Multiskan MK3 Thermo scientific；尼康Eclipse 55i/50i 生物显微镜；电热恒温培养箱：ICV-450 日本ASONE；电热恒温水浴锅：HH-4 数显双列四孔水浴锅，常州华冠仪器制造有限公司生产。

2 方法

2.1 动物模型制备

2.1.1 妊娠大鼠模型建立方法

参照《药理实验方法学》[2]：取雌性大鼠阴道分泌物作脱落细胞检查，连续2 周，选出具有显著且稳定动情期雌鼠77只，将该77 只雌鼠与雄鼠按2:1 合笼过夜，次日清晨查看雌鼠阴道栓，发现阴道栓视为妊娠第1 天，若无阴道栓者则取阴道分泌物在显微镜下观察，发现精子也视为妊娠第1 天。

2.1.2 动物分组与肾虚先兆流产动物模型制备

参照《人类疾病动物模型》[3]：将72 只孕鼠随机编号分为6 个组，分别为空白对照组、模型组对照、保胎灵组、保胎方高剂量组、中剂量组、低剂量组。除空白对照组外，余组在妊娠第3-12 天，每天下午灌胃羟基脲(450mg/kg)[4]2mL，至妊娠第12 天，于末次羟基脲灌胃6 小时后分别灌米非司酮溶液(RU486)3.75mg/kg2mL[5]，以诱发SD 孕鼠先兆流产，模型制备完毕。

2.2 给药方法

自妊娠第3 天始，至第12 天，空白对照组：早晨、下午生理盐水灌胃分别2mL/次。模型对照组：早晨生理盐水灌胃2mL/d。保胎灵组：早晨保胎灵0.7g/kg/d 灌胃，2mL/日。保胎方高、中、低剂量组：早晨保胎方水煎剂灌胃分别43.12g/kg/d、21.56g/kg/d、10.78g/kg/d 各2mL。

2.3 观测指标

(1)在体子宫宫缩实验：妊娠第13 日(灌胃米非司酮24小时后)，麻醉后暴露子宫，将子宫用丝线与肌张力换能器连接，记录子宫平滑肌运动曲线。观察子宫收缩张力(g)和频率(次/20min)。(2)激素测定5%戊巴比妥麻醉后，摘眼球采血。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测：血清孕酮(P)、雌二醇(E2)、β-HCG。

2.4 统计学处理方法

采用SPSS 16.0 统计软件进行分析和处理，实验结果以(±s)表示，数据方差齐性，呈正态分布，采用ANOVA 单因素方差分析，组间两两比较使用LSD 检验，方差不齐时采用Tamhane’sT2 检验。

3 结果

实验过程中，空白组大鼠不明原因死亡1 只、灌胃死亡1只；模型组大鼠麻醉死亡1 只、灌胃死亡1 只、采集血标本溶血剔除1 只、检测指标差异明显剔除1 只；保胎灵组麻醉死亡1 只、灌胃死亡1 只、采集血标本溶血剔除1 只；保胎方高剂量组大鼠不明原因死亡1 只、灌胃死亡2 只；保胎方中剂量组大鼠麻醉死亡1 只、灌胃死亡1 只、采集血标本溶血剔除1 只；保胎方低剂量组大鼠灌胃死亡2 只。

3.1 保胎方对先兆流产大鼠血清E2、P、β-HCG 的影响

与模型对照组比较，空白对照组E2、P、HCG 的浓度均较高(P＜0.05)，保胎方各组、保胎灵组E2、HCG 的浓度明显升高(P＜0.05)，保胎方中、高剂量组及保胎灵组P 的浓度均升高(P＜0.05)；与保胎灵比较：E2 中保胎方各组差异无统计学意义(P＞0.05)，保胎方中、高剂量组P 的表达、保胎方中剂量组HCG 较保胎灵组高(P＜0.05)；保胎方高剂量组E2 高于中、低剂量组(P＜0.05)；保胎方中、高剂量组P 的表达、保胎方中剂量组HCG 含量高于低剂量组(P＜0.05)(见表1)。

表1 保胎方对先兆流产大鼠血清E2、P 及β-HCG 的影响(±s)

表1 保胎方对先兆流产大鼠血清E2、P 及β-HCG 的影响(±s)

注：采用LSD 检验，与模型对照组比较，#P＜0.05；与保胎灵组比较，ΔP＜0.05；与保胎方中剂量组比较▲P＜0.05，与保胎方低剂量组比较◆P＜0.05。

组别 例数(只) 剂量[g/(kg·d] E2(Pg/mL) P(ng/mL) β-HCG ( ng/mL )空白对照组 10 — 268.946±33.592# 105.932±10.363# 0.429±0.076#模型对照组 8 — 148.557±34.609 80.156±9.400 0.235±0.061保胎方低剂量组 10 10.780 259.717±31.413# 85.326±8.143 0.329±0.046#保胎方中剂量组 9 21.560 260.219±52.477# 101.883±4.790# △◆ 0.425±0.037# △◆保胎方高剂量组 9 43.120 270.692±47.853#▲◆ 97.525±6.333# △◆ 0.382±0.066#保胎灵组 9 0.700 257.495±34.093# 94.196±11.785# 0.349±0.074#

3.2 保胎方对先兆流产大鼠在体子宫宫缩的影响

与模型对照组比较，空白对照组、保胎方各组和保胎灵组子宫收缩张力及频率均较低(P＜0.05)；保胎方各组宫缩张力、宫缩频率与保胎灵组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；保胎方中、高剂量组宫缩张力、高剂量组宫缩频率均小于低剂量组(P＜0.05)(见表2)。

表2 保胎方对先兆流产大鼠在体子宫收缩张力及频率的影响(±s)

表2 保胎方对先兆流产大鼠在体子宫收缩张力及频率的影响(±s)

注：采用LSD 检验，与模型对照组比较，#P＜0.05；与保胎灵组比较，ΔP＜0.05；与保胎方低剂量组比较◆P＜0.05。

组别 例数(只) 剂量[g/(kg·d] 宫缩张力(g) 宫缩频率(次/20min)空白对照组 10 — 5.274±0.765# 7.190±0.912#模型对照组 8 — 8.344±1.125 11.164±1.535保胎方低剂量组 10 10.780 7.311±1.258# 8.343±1.317#保胎方中剂量组 9 21.560 6.097±1.384#◆ 8.073±1.180#保胎方高剂量组 9 43.120 5.627±0.804#◆ 7.747±0.713#◆保胎灵组 9 0.700 5.658±0.933# 7.568±0.731#

4 讨论

丁氏妇科补肾养血保胎方是丁氏妇科第十代传人丁丽仙教授据肾气亏虚、气血不足、冲任不固之先兆流产所创的保胎经验方，丁教授认为其病因为先天禀赋不足，或房劳多产，或孕后房事不节等。《素问·六节藏象论》云：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”，《素问·上古天真论》曰：“女子七岁，肾气盛，……二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子。……七七任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，形坏而无子。”肾藏精，主生殖，胚胎的孕育依赖先天之精，又依赖后天之精血滋养，《傅青主女科》说：“脾健则血旺而荫胎”。《素问·奇病论》曰：“胞络者，系于肾。”冲为血海，任主胞胎，冲任之本在肾，肾之精气充足，系胎稳固；《格致余论·胎自堕论》云：“血气虚损，不足荣养，其胎自堕”；肾系胎，脾载胎，血养胎，若肾虚固胞无力，胎失所系，脾虚冲任匮乏，胎失所养，则发生胎漏、胎动不安、妊娠腹痛，丁教授据此立方，其药物组成为黄芪、党参、炒白术、菟丝子、桑寄生、枸杞、续断、杜仲、白芍、砂仁、阿胶珠、仙鹤草、甘草等，方中桑寄生、菟丝子、杜仲、续断、枸杞补肾益精、固摄冲任，肾旺则胎自安；黄芪、党参、炒白术、甘草健脾补气助生化之源，使气旺以载胎；阿胶珠滋阴养血，止血安胎；白芍养血柔肝，助阿胶珠补血养胎；白芍、甘草缓急止痛安胎；砂仁理气安胎；仙鹤草收敛止血。全方先后天同补，共奏补肾健脾，养血止血，固冲安胎之功。现代药理研究表明，菟丝子提高HCG、黄体生成素LH受体功能，改善生殖内分泌[6]。白术抑制兴奋的子宫平滑肌，减缓子宫对胚胎的刺激作用[7]。川续断总生物碱抑制妊娠大鼠在体子宫平滑肌收缩，降低收缩幅度和张力，对抗0.25U/kg催产素诱发妊娠大鼠的子宫收缩幅度和张力[8]。杜仲叶冲剂抑制离体大鼠子宫收缩，具有安胎作用。杜仲皮和叶的化学成分和药理作用十分相似，可以叶代皮供药用[9]。芍药甘草汤有抗炎、镇痛、解痉作用，能使多脏器平滑肌松弛，解除痉挛[10]。

E2 在孕妇体内可使子宫内膜增厚，协助孕激素发挥作用，并对保持黄体的期限有一定作用[11]；E2 尚有调节免疫的作用，降低T 淋巴细胞对滋养细胞的排异反应。P使子宫内膜间质细胞转化为蜕膜细胞，并含有丰富的糖元颗粒供给胚胎营养，防止蜕膜的退变；P可抑制子宫肌的兴奋性，降低子宫肌对各种刺激的敏感性，维持妊娠；调控NK 细胞和T 淋巴细胞以抑制免疫反应，保护胚胎不被母体排斥而流产[12]。本研究中模型组血清E2、P水平明显低于空白组和药物组，与赵慧茹[13]等、宋芳[14]等的研究相符。保胎方可提高E2、P水平支持胚胎发育，并降低母体排斥反应达到保胎的作用。

β-HCG 能维持月经黄体寿命，使月经黄体增大成为妊娠黄体，增加甾体激素的分泌以维持妊娠，将雄激素转变为雌激素，同时刺激孕酮的形成；并吸附于滋养细胞表面以免胚胎滋养层被母体免疫淋巴细胞攻击[15]。本实验发现：模型组β-HCG 明显低于保胎方中、低剂量组，与陈勇等[16]研究相符。保胎方能提高β-HCG 水平达到保胎的作用，效果优于保胎灵。此实验结果可能与方中菟丝子、续断、桑寄生、阿胶珠等具有雌激素样活性，提高人绒毛膜促性腺激素含量，促进离体培养人早孕绒毛组织HCG 的分泌，改善生殖内分泌功能[6]的现代药理作用有关。

在妊娠早期，正常的子宫收缩有利于受精和胚胎的着床，增强绒毛间隙和子宫血窦的血液循环，维持妊娠[16]。若提前出现子宫生理性收缩或强度增加导致囊胚营养吸收不良，甚或绒毛与蜕膜分离剥脱，蜕膜小血管受损，出现绒毛膜下血肿或阴道不规则流血。本研究结果表明，保胎方可降低平滑肌收缩频率和张力，其作用机制可能为直接作用于子宫平滑肌减少其收缩频率和张力，也可能为通过提高P含量间接减少子宫平滑肌的张力。该实验结果可能与方中续断、杜仲、白术、芍药、甘草抑制平滑肌收缩的药理作用有关。

综上所述，丁氏妇科补肾养血保胎方可通过提高血清E2、P、β-HCG 的浓度，支持胚胎生长、发育，同时减少子宫平滑肌收缩频率、张力，抑制子宫平滑肌异常收缩而有助于胚胎在宫腔内继续发育、提高妊娠率。本实验中，保胎方中、高剂量对多个指标的改善有较低剂量好的趋势，具体的量效关系需作进一步研究。本实验从对相关激素及妊娠子宫平滑肌影响的角度，为临床使用本方提供了科学依据，其具体作用机制尚有待进一步研究。