iTRAQ技术在消化道肿瘤研究中的应用进展

陈敏 刘莉萍 综述 张玲 审校

同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技术是近年来发展迅速的一种实验技术，它能够对细胞和组织内蛋白质的结构、修饰、功能和表达情况等信息进行大规模、全方位的研究。在过去几十年中，针对消化道恶性肿瘤的研究已经取得了显著的进展，但在肿瘤的发生机制、临床检测以及治疗预后等方面仍有待进步。iTRAQ技术作为一种新的定量蛋白质组学技术，在消化道肿瘤的应用中比以往双向电泳技术、同位素亲和标记技术具有更加明显的优势[1]，该技术不仅可以为疾病做出早期检测，而且可以用来阐明疾病的复杂分子机制，更能为消化道肿瘤治疗和预后提供更有效的方法。事实上，许多其他恶性疾病的研究中已经用iTRAQ结合LC/MS等技术来研究蛋白质组谱，该技术亦有可能为探索消化道肿瘤提供一种全新的方法。因此本文分析相关文献资料后，现就iTRAQ技术在消化道肿瘤研究中的应用进展综述如下。

1 iTRAQ技术在食管癌领域中的研究进展

食管癌包括食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma，EAC)，是第八大常见的癌症，也是全球与癌症相关的第六大常见的死亡原因，其中ESCC在全球范围内较为普遍，占全部食管癌的90%[2]。虽然早期诊断、手术策略以及辅助治疗等方法对于食管癌的发生发展有所改善，但ESCC患者的预后仍然很差，5年总生存率仅为15%～25%[3]。许多研究发现NK1R的高表达预示着疾病已发展至晚期并提示更差的预后。在2019年Wang等[4]采用免疫组织化学、蛋白质印迹分析等方法检测了NK1R在人ESCC细胞系EC109中的表达，结果证实NK1R在ESCC上调，其过表达与肿瘤大小、肿瘤浸润深度、神经周围浸润程度相关，最终导致总生存率降低。并通过iTRAQ蛋白谱和生物信息学分析进一步研究NK1R在ESCC增殖中作用的下游机制。结果表明，与EC109-NK1R-NC(阴性对照)细胞相比，EC109-NK1R-KD(NK1R敲除)细胞中有440种蛋白质发生了显著变化(84种蛋白质上调，356种蛋白质下调)，并进一步分析鉴定了15个分子，其中Hes1被鉴定为有功能相关性和表达意义的目标。因此他们假设NK1R通过调节Hes1的表达，并最终促进ESCC的细胞增殖。这一研究中iTRAQ技术为进一步探究食管肿瘤细胞增殖机制提供了易操作性的实验技术方法。此外有研究发现，ILK的异常表达与ESCC的发生发展有关。Ma等[5]应用iTRAQ技术筛选与ESCC放化疗疗效相关的血清差异表达蛋白。结果显示食管癌患者(放化疗前)的ILK表达水平高于对照组(放化疗后)，放化疗敏感患者的ILK表达水平低于放化疗耐受组。这些发现表明ILK的异常表达可能与ESCC的发生发展有关，ILK可能参与放化疗敏感性调节。通过进一步研究ILK表达对ESCC细胞特性的影响，目前的研究首次表明ILK沉默显著抑制增殖、侵袭和转移，促进ESCC细胞凋亡。综上所述，运用iTRAQ技术不仅能探究食管癌细胞的增殖机制，而且可以深入了解食管癌放化疗耐药的分子机制，探索靶向放化疗耐药的新策略，这将对食管癌患者提高治疗效果具有重要的临床意义。

2 iTRAQ技术在胃癌领域中的研究进展

胃癌是具侵袭性的恶性肿瘤之一。全球有近100万病例，在全球癌症发病率位居第五，死亡率位居第三[6]。目前胃癌生物标志物显示出临床诊断敏感性和特异性不足[7]，所以迫切需要更可靠的临床生物标志物，并开发准确有效的胃癌诊断方法，尤其是早期筛查方法。有研究发现正常细胞和胃癌细胞之间异常表达的细胞表面蛋白可能用于发现新的胃癌生物标志物。Yang等[8]使用iTRAQ试剂分别对非癌细胞HFE145和癌细胞MKN7进行标记，共鉴定了873种蛋白质，其中175种蛋白质在非癌上皮细胞和胃癌上皮细胞之间的表达有大于1.3倍的差异。而在这其中，74种蛋白在胃癌中表达不足，而与非癌细胞相比，101种蛋白在胃癌中表达过量。而后用蛋白质印迹分析验证iTRAQ数据，证明SLC3A2和LAMP-2是潜在的新型胃癌相关蛋白。因此用稳定同位素定量蛋白质组学方法，从正常细胞和胃癌细胞中提取富含膜样品的整体蛋白质组，将把生物标志物发现领域引入新的可能。迄今为止包括化疗、放疗和手术在内的多模式治疗策略已经显著限制了胃癌的进展，并且全身转移率已经显著降低。然而，肿瘤转移和复发仍然是胃癌患者死亡的主要原因。Li等[9]采用iTRAQ技术、逆转录聚合酶链反应等方法，证明了CLIC1表达下调能有效抑制胃癌在体内外的迁移和侵袭，促进细胞凋亡，并不同程度地改变ITG家族蛋白(包括ITGα1、ITGα3、ITGαv和ITGβ1)的表达。此外，胃癌作为影响人类的最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其早期症状较隐匿，一般确诊胃癌时已是进展期胃癌，因此抑制胃癌细胞的增殖成为目前治疗胃癌的方法之一。近年来大蒜素(Diallyl trisulfide，DATS)对消化道肿瘤细胞的抑制作用越来越受到肿瘤研究领域的关注和重视，大量研究提示大蒜素可以抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡[10]。王浩冉等[11]在研究中发现，胃癌细胞(BGC823)同步化后再次加入DATS处理12 h，发现凋亡细胞的比例增加，提示DATS处理后引起细胞中期阻滞和凋亡的增加，可诱导胃癌细胞发生有丝分裂危象，但有丝分裂危象最终通过何种途径引起细胞死亡以及DATS在诱导细胞发生有丝分裂危象时的蛋白质调控网络、生物功能及细胞信号通路，还有待深入研究。因此在本项目的后续研究中，要运用iTRAQ和IPA相结合的方法，多重网络比较分析DATS同步化调控与非同步化调控胃癌细胞后两组差异蛋白以及关键信号通路，并对有丝分裂危象进行深入研究，以期为DATS诱导治疗胃癌提供理论依据。

3 iTRAQ技术在肝癌领域中的研究进展

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是临床最难治疗的恶性肿瘤之一，2018年其致死率在全球常见癌症中位居第四，仅次于肺癌、结直肠癌和胃癌[12]。虽然我们对HCC已经有了越来越深入的了解，然而对于HCC发生的分子作用机制仍然知之甚少。Cheng等[13]在37对HCC组织及其邻近的非肿瘤组织中检测了miR-449a的表达，与邻近的非肿瘤组织相比，在HCC组织中发现miR-449a的表达显著降低。为了阐明受miR-449a表达降低影响的分子事件，在miR-449a丢失或获得后，在HCC细胞系Bel-7402中应用iTRAQ技术和2D液相色谱-质谱分析鉴定和定量了3702个非冗余蛋白质，IPA分析在调节蛋白中鉴定出几个与HCC发展有关的重要蛋白质，包括HDAC1、CDK6、MET、TPD52、BAG1、RPS27L、TAX1BP3、TAGLN和TFCP2。iTRAQ技术和IPA分析揭示了miR-449a通过靶向CDK6和细胞周期蛋白D1来阻止G1阶段，抑制细胞增殖、减弱侵袭力，抑制HCC的发生发展。此外治疗后的高转移率和复发率是许多肝癌患者的致命临床因素，所以若能找到HCC转移和复发的靶点，则有望提高肝癌患者的生存率。Lin等[14]应用iTRAQ蛋白组学分析和细胞功能实验研究了HCC细胞转移的机制，表明了CD9可能促进HCC细胞的转移。这些研究结果表明，通过iTRAQ技术和IPA分析等方法探索HCC分子之间的内在联系和相互作用有助于理解HCC肿瘤的发展机制，或许可以为HCC的治疗开发更有效的方法；而理解肿瘤转移的潜在机制对于开发针对HCC的有效治疗靶标亦至关重要，甚至可能为HCC的预后提供新的可能。

4 iTRAQ技术在胆道肿瘤领域中的研究进展

胆管癌(Cholangiocarcinoma，CCA)是一种起源于胆管上皮的异质性恶性肿瘤，是胆道最常见的原发性恶性肿瘤[15]，不可切除CCA患者的中位生存期不到1年[16]。对于接受根治性切除手术的患者，预后要好得多，5年生存率约20%～40%[17]。然而即使结合非特异性生物标志物，以及使用先进的成像技术也难以在早期检测CCA，晚期胆管恶性肿瘤施行外科手术以及化疗的疗效也均差强人意[18]。Ren等[19]使用iTRAQ和液相色谱-串联质谱法进行定量蛋白质组学分析，鉴定富含铬化砷酸铜细胞的分泌蛋白，并与正常胆管上皮细胞系进行比较，共有778种蛋白质被鉴定为差异表达蛋白质，并使用生物信息学分析进行分类。最后，他们确认肿瘤蛋白D52(TPD52)和DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)成员B1(DNAJB1)为生物标志物，其在CCA细胞中上调，并且发现TPD52和DNAJB1的过表达可能预示着CCA患者的不良预后，这项研究的结果可能为CCA的诊断和治疗提供新的见解。此外，Tang等[20]使用iTRAQ技术结合液相色谱-质谱(LC/MS)技术在6对原发癌和癌周组织中，共鉴定出了2 886个蛋白质(≥95%的置信度)。其中，233种蛋白在癌旁组织和癌组织中差异表达(99种上调，134种下调)。然后选择了差异表达蛋白质中具有特异性的PRDX2、BGN、LUM和PP3CA作为潜在的生物标志物用于进一步的检测，最后发现PP3CA是CCA患者独立的不良预后因素，也是预测手术切除CCA患者预后的具有重要作用的标记。可见，高蛋白质组覆盖率和高标记效率的iTRAQ技术已经成为预测CCA患者诊断和预后的可靠生物标志物的一种有前途的技术。

5 iTRAQ技术在胰腺癌领域中的研究进展

胰腺癌是目前最严重的消化道恶性肿瘤之一，具有症状不典型疾病进展迅速的特点，临床上没有敏感的早期诊断指标[21]。因此迫切需要在胰腺癌上进行更加深入的研究，应用现代技术来增加对这种疾病的了解，提高对无症状胰腺癌患者的诊断能力。鉴于胰腺癌无症状的性质，微创的血液化验依然是首选[22]。Li等[23]收集了健康个体、良性疾病患者和胰腺癌患者的外周血单核细胞(PBMCs)，采用iTRAQ-2D-MS/MS和SWATH方法对PBMCs进行了蛋白质组学分析。结果共鉴定出3 357个蛋白质，其中胰腺癌组发现差异蛋白114个(上调蛋白35个，下调蛋白79个)。根据生物信息学分析，AOPA1和CCS具有显著的上下调节，于是选择了APOA1和CCS进行蛋白免疫印迹验证，结果证明这两种蛋白可以显著区分胰腺癌组与对照组，可能是血中胰腺癌的临床相关生物标志物，提示它们可能作为PBMCs中的生物标志物来诊断胰腺癌。显然，高效的iTRAQ技术在血液生物标志物的大规模样本分析中展现出广阔的临床应用前景。其次，虽然胰腺癌手术方式和放化疗方案有了长足发展，但胰腺癌仍然是致死率最高的恶性肿瘤，5年总生存率仅约为4%[24]。Lei等[25]采用原位杂交和快速定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法，证明lincRNA00976在胰腺癌组织和细胞系中过度表达，并与胰腺癌患者的较差生存率呈正相关。功能研究显示lincRNA00976敲除在体内和体外显著抑制细胞增殖、迁移和侵袭，而其过度表达逆转了这些效应，而后使用iTRAQ分析发现OTUD7B是介导胰腺癌发生的lincRNA00976的功能宿主基因，并促进肿瘤增殖和转移。因此，iTRAQ技术对于进一步研究胰腺癌的发生发展机制十分重要，特别是寻找有效的治疗靶点，并且对于提高胰腺癌的疗效和预后具有重要意义。

6 iTRAQ技术在结直肠恶性肿瘤领域中的研究进展

据全球癌症统计报告显示，在全球癌症发病率中，结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)的发病率在人群中排名第三，死亡率排名第二[26]。尽管早期诊断使结直肠癌的5年相对生存率有所提高，但结直肠癌仍然是最致命的恶性肿瘤之一。大约60%的患者确诊时已处于晚期，其5年生存率在13%左右[27]。因此了解结直肠癌发生的分子机制将有助于改善早期检测和预后，并提供新的治疗靶点。Peng等[28]用iTRAQ技术联合2D液相色谱-串联质谱法分析鉴定人结肠上皮细胞致癌过程中有326种蛋白质为差异表达蛋白。免疫组化进一步验证了4个在致癌过程中发生进展性改变的差异表达蛋白质(DMBT1、S100A9、半乳糖凝集素-10、S100A8)，结果表明差异表达蛋白质参与多种生物过程，包括细胞周期、细胞粘附、翻译、基因加工和蛋白质合成。这些发现为我们理解结直肠癌的发生机制提供了基础，并为进一步研究癌变和鉴定生物标志物提供了线索。此外，基于结直肠癌早期症状隐匿，晚期化疗药物的不良反应大，耐受性差等原因，寻找结直肠癌最佳药物治疗就具有了重要意义。Chen等[29]研究发现薯蓣皂苷可以引起线粒体损伤和G2/M细胞周期阻滞，并显著抑制人HCT-116结肠癌细胞增殖。进一步应用iTRAQ蛋白质组学方法，有288种明显不同的蛋白质在薯蓣皂苷的反应中表达，它们相互关联并参与不同基因组途径。然后将一些参与氧化磷酸化、Wnt、p53和钙信号通路的差异表达蛋白通过蛋白质印迹和定量实时聚合酶链反应进行验证，表明这些蛋白可能是未来结直肠癌治疗的有用靶点。

7 小结与展望

iTRAQ技术定量蛋白质组学作为蛋白质研究的前沿学科，不仅有助于揭示生命活动规律，还能为众多疾病发病机理的阐明提供理论依据，它所具有的大规模、高通量等优势为消化道恶性肿瘤的机制研究提供了新的可能。大量研究也均已证实，通过利用iTRAQ技术可以对消化道肿瘤进行全面的蛋白质组学研究并具有良好的重复性、可信性及敏感性。但是该技术仍存在其缺陷，如iTRAQ试剂比较昂贵、iTRAQ标记的样本因先经过胰蛋白酶消化造成了样本处理过程中可能产生误差等。很显然，重大挑战仍然存在于蛋白组学研究中，因此如何将iTRAQ技术更好的应用在消化道肿瘤蛋白组学中可谓任重而道远。