水凝胶在脊髓损伤动物实验中的应用研究进展

吴培琪 洪冬纯 黄思源 翁崇蓉 宋江涛 姚颖 白璐 汪校帅*

脊髓损伤是脊髓遭受外力打击后，损伤节段以下运动、感觉功能不完全或完全丧失的一种高致残率的损伤。近年来，脊髓损伤的发生率逐渐升高[1]，如何有效修复脊髓损伤成为当今临床研究的热门课题。

脊髓损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。脊髓损伤后，损伤部位神经元坏死，诱发炎症反应，随后神经胶质细胞增生形成胶质瘢痕，损伤部位还可形成大小不等的囊肿腔。炎症反应、胶质瘢痕、囊肿腔均可抑制轴突生长，形成永久性损伤。相关研究表明，损伤后利用水凝胶进行治疗，可以抑制炎症反应，减少胶质瘢痕形成，减小囊肿腔体积，促进髓鞘再生等，减少继发性损伤带来的伤害。

水凝胶是一种具有三维网络结构的功能高分子材料，在吸收大量水或组织液后溶胀，具有良好的生物相容性。临床上可利用水凝胶搭载细胞、细胞因子、小分子药物等。在脊髓损伤的治疗中，水凝胶可以模拟细胞外基质，为神经细胞或干细胞提供黏附位点，促进其增殖、分化，搭载细胞因子或药物，促进脊髓损伤处神经纤维再生，甚至恢复部分功能。

本文回顾了2015—2018 年水凝胶及其相关的细胞治疗、分子治疗在脊髓损伤治疗领域的研究进展，重点关注其促进神经元再生、抑制胶质瘢痕增生等方面的作用，对水凝胶注射时间进行相关讨论。

1 水凝胶在脊髓损伤类型中的应用

目前，应用水凝胶治疗脊髓损伤仅限于动物实验阶段，动物模型多为大鼠，少量为小鼠和狗。在实验过程中，研究者普遍先手术切开大鼠椎板，构建脊髓损伤模型（全横断、半横断和挫伤），移植搭载有特定物质（如细胞因子、多能干细胞等）的水凝胶，随后评估其运动功能恢复情况，并取原损伤节段脊髓进行免疫组化、形态学分析等方面的研究。

1.1 搭载细胞的水凝胶

脊髓损伤可破坏原有解剖结构，造成局部组织的缺损、坏死和瘢痕组织的形成。单纯移植细胞，由于缺乏足够的空间和有效支撑，细胞遭到挤压破坏，生长成杂乱的细胞团，难以与周围组织形成突触结构[2]。Führmann 等[3]用RGD肽和血小板衍生生长因子修饰透明质酸甲基纤维素水凝胶。体外实验表明，经修饰的水凝胶可通过提高与细胞的黏附能力，促进移植细胞的早期存活和整合。此外，Caron 等[4]用3D 细胞外基质涂覆生物材料作为载体，搭载骨髓间充质干细胞，显著调节小鼠脊髓损伤模型中的促炎环境，增加M2巨噬细胞数量，促进原位再生环境的形成。

Gomes 等[5]在实验中，对小鼠的L1水平脊髓进行半横断，并在损伤部位注射不同物质:实验组，注射含有脂肪组织来源干细胞（adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs）和嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的GRGDS 肽修饰的结冷胶（gellan gum hydrogel）;注射ASCs 和OECs;注射GRGDS 肽修饰的结冷胶;脊髓损伤后未处理组;仅椎板切除、无脊髓损伤组。与其他组相比，实验组的小鼠在BBB 评分（Basso，Beattie，Bresnahan Locomotor Rating Scale，BBB）中得分更高，躯体运动能力有较大改善。组织学检查中，实验组小鼠损伤部位的神经丝蛋白表达水平显著高于未处理组，并减少胶质瘢痕形成，促进轴突再生。免疫组化结果表明，实验组小鼠损伤部位的CD11b/c 及胶质细胞原纤维酸性蛋白表达水平均有降低，炎症反应减弱。与单独注射细胞组相比，实验组在损伤部位观察到更多脂肪组织来源干细胞聚集。

此外，在Raynald 等[6]的实验中，搭载人骨髓基质干细胞的水凝胶可通过促进轴突再生显著恢复脊髓损伤小鼠的运动功能。

2.2 搭载细胞因子或药物的水凝胶

Wang 等[7]以甲基丙烯酸羟乙酯-三甲基氯化铵水凝胶作为药物递送系统，向脊髓损伤部位持续释放碱性生长因子，促进脊髓损伤后的神经组织再生和功能恢复。此外，Zhao 等[8]合成了神经生长因子-肝素泊洛沙姆温敏水凝胶，显著提高细胞对神经生长因子的摄取效率，对脊髓损伤大鼠模型中胶质瘢痕的形成有明显的抑制作用。

Nguyen 等[9]研究发现，与仅注射水凝胶的对照组相比，搭载神经营养因子-3 以及miR-222 的水凝胶可以在损伤部位持续释放药物和核酸分子，促进轴突再生以及再髓鞘化，促进脊髓损伤小鼠的功能恢复。

Wen 等[10]的实验中，搭载脑源性生长因子、血管内皮生长因子的聚乳酸乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]水凝胶混和抗Nogo 受体的抗体，通过下调Rho GTP酶的活性，降低损伤部位Rho 相关激酶以及胶质细胞原纤维酸性蛋白的表达水平，抑制星形胶质细胞在损伤边缘聚集，减少胶质瘢痕的形成。

近年来的研究证明，海藻酸盐水凝胶可显著减少损伤部位对侧脊髓白质的脱髓鞘化[11]，还可通过激活M2 型巨噬细胞，促进其增生，减少损伤部位炎症反应[12]。纤维蛋白水凝胶对内源神经元细胞迁移及增殖具有诱导作用，并可作为生物活性连接引导轴突生长[13]。

2 水凝胶在脊髓损伤模型中的使用时间

Hejcl 等[14]在不同时期使用带正电荷的聚甲基丙烯酸羟乙酯树脂（2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA）水凝胶治疗脊髓损伤大鼠模型。结果 显示，损伤后1 周使用水凝胶较损伤后立即使用水凝胶形成的假性囊肿腔体积更小，促进神经轴突和血管的再生与连接。

Chen 等[15]参考了Hejcl 等的实验结果，同时考虑了生长因子的释放时间，选定术后5 d 移植水凝胶。经检测，碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）在全横断发生3 d 后达到峰值，出现峰值后（术后5 d）植入搭载bFGF 的水凝胶，使bFGF 平稳保持较高水平。实验结果显示，实验组大鼠相较对照组而言，前者在BBB 运动评估系统中获得更高的分数，但并未有效减少瘢痕增生。

Tavakol 等[16]在大鼠T9节段构建挫伤模型，术后10 d移植含层粘连蛋白基序CQAASIKVAV（CQIK）的水凝胶，并搭载人类子宫内膜源性基质细胞。挫伤形成后第42 d，检测到移植上述水凝胶的大鼠在BBB 运动评估系统中比只注射PBS 的对照组大鼠获得更高分数，有效促进损伤位点的轴突再生，抑制胶质瘢痕和炎症的形成，促进脊髓损伤修复。

3 讨论

常见的脊髓损伤模型有3 种: 挫伤、全横断、半横断。挫伤是生活中常见的脊髓损伤类型，可以在不破坏硬脊膜的情况下造成脊髓大范围损伤并形成囊肿[17]。全横断模型由于局部脊髓损伤范围大，且破坏血液运输，增加继发变性，影响脊髓损伤修复疗效的评估，较少在动物实验中应用。半横断模型具有与健侧对照的优点，本文纳入的实验大部分都采用半横断脊髓损伤模型。

水凝胶作为一种新型功能高分子材料，可作为支架搭载细胞、细胞因子、小分子药物等至脊髓损伤部位。相较于普通的细胞支架而言，水凝胶可以在原位注射，快速由液态转化为固态，以适应不同形状的脊髓损伤位点。常用水凝胶可分为以下几类:天然高分子类水凝胶;合成类水凝胶;经修饰的水凝胶;自组装肽。天然水凝胶具有良好的生物相容性，在脊髓损伤动物实验中得到广泛应用。不同种类的天然水凝胶有不同的特点，如透明质酸水凝胶可明显减少脊髓损伤处胶质瘢痕形成[18]，海藻酸盐水凝胶可显著减少损伤部位对侧脊髓白质的脱髓鞘化[11]，壳聚糖水凝胶可激活巨噬细胞，促进其增生，减少炎症反应[12]，琼脂糖类水凝胶可搭载小分子药物，维持损伤部位有效药物浓度[19]。合成类水凝胶可根据需要对其化学结构做出调整，使其更适宜脊髓损伤微环境。合成类水凝胶可用于搭载细胞，搭载施旺细胞的寡聚（乙二醇）延胡索酸酯水凝胶可促进脊髓损伤部位轴突再生和髓鞘形成[20]。对水凝胶进行修饰可增加水凝胶与细胞的黏附，RGD 肽修饰的透明质酸甲基纤维素水凝胶可促进少突胶质细胞祖细胞的早期存活和整合[3]。自组装肽可因其交替排列的正负电荷发生原位组装，具有良好的吸水性。RADA16-Ⅰ是常见的自组装肽，但因其使用所需pH较低而受到限制，而基于SAP改良的纳米纤维水凝胶-IKVAV/-RGD（神经突增生肽/细胞黏附肽）在动物实验中被证明较RADA16-Ⅰ更有效地促进轴突再生和髓鞘形成[21]。水凝胶种类多，且各有特性，研究时需根据动物实验方案和实验目的选择相应的水凝胶，也可根据实验需要对水凝胶进行修饰。

Gomes 等[5]在损伤位点移植搭载脂肪组织来源干细胞、嗅鞘细胞的水凝胶，相较仅移植水凝胶的对照组而言，前者在组织学检查和功能检查中均有更好的表现。而在Elizalde-Peña 等[22]的实验中，仅对损伤小鼠注射了水凝胶，小鼠运动功能未得到明显恢复。大量动物实验结果表明，在脊髓损伤治疗中，水凝胶需要与细胞、细胞因子或药物等结合，才能发挥显著的治疗作用。水凝胶可搭载具有分化能力或分泌细胞因子的细胞，促进血管生成，减少炎症反应，而搭载细胞因子、小分子药物的水凝胶可缓慢释放细胞因子、小分子药物，促进脊髓修复。

总体而言，水凝胶可作为支架提供细胞黏附位点，减少细胞凋亡，促进神经元再生; 改善局部微环境，减少炎症细胞聚集及胶质瘢痕形成; 持续释放所搭载药物或细胞因子，延长药物作用时间。

4 结论

脊髓损伤可造成中枢神经系统感觉运动功能的不可逆性损伤，脊髓损伤的救治和康复问题是医学发展的重大挑战。目前，改善局部再生微环境以有效支持神经再生是治疗脊髓损伤的重要研究方向。水凝胶不仅可为所搭载细胞提供支持，同时可维持所搭载细胞因子的持续局部释放，调节细胞活动，减少炎症反应和瘢痕增生。

目前，水凝胶的研究仍停留在动物实验阶段，水凝胶的最佳使用时间仍有待进一步探讨，如何实现水凝胶在脊髓损伤中的临床转化也是未来水凝胶研究的一个重要方向。