特殊的皮肤施万细胞介导疼痛

1.研究背景

感知并保护生物体免受伤害性刺激的能力依赖于感觉传入神经，这种感觉传入神经被称为伤害性感受器。通常认为伤害性感受器的神经纤维是无髓鞘的，与之相连的Remak 胶质细胞起到保护和支持神经轴突代谢的作用。这种无髓神经的末梢可以被伤害性刺激所激活，因此被称作皮肤的痛觉感受器。该研究使用表达在神经嵴并且是胶质细胞特异的Cre 系小鼠与报告基因小鼠交配进行遗传学标记，研究皮肤胶质细胞（施万细胞）的分布及其与伤害性神经末梢之间的相互联系。

2. 主要研究方法

研究者主要使用Plp-CreERT2/+; R26REYFP/+(Plp-YFP)、Sox10CreERT2/+; R26RTOM/+(Sox10-TOM) 和Sox2CreERT2/+; R26RTOM/+(Sox2-TOM) 品系的小鼠，采用免疫荧光技术，借助荧光显微镜、透射电镜及免疫电镜观察皮肤施万细胞分布情况及其与伤害性神经末梢之间的相互联系。

使用Plp-CreERT2/+; R26RChR2/+(Plp-ChR2)、Sox10CreERT2/+; R26R ChR2/+(Sox10-ChR2)、Sox2CreERT2/+; R26R ChR2/+(Sox2-ChR2) 和Sox-10CreERT2/+; R26R ArchT/+(Sox10-ArchT) 品系的小鼠，采用光遗传技术操控施万细胞，观察小鼠疼痛相关行为学变化。从外周组织分离培养末梢施万细胞，采用细胞外记录及全细胞膜片钳技术，检测伤害性施万细胞的电学特征。

3. 主要研究结果

在Plp-YFP 和Sox10-TOM 小鼠中，与神经标记物PGP9.5 染色的双标实验显示无论是在有毛皮肤还是在无毛皮肤，施万细胞均处于真皮内的相同位置，位于接近真皮/表皮边界，并与上行性神经纤维紧密接触。此外PlpYFP+、SOX10+和S100b+细胞具有向表皮广泛伸出的放射状突起，这一特点与其他的施万细胞形态一致。透射电镜结果显示从施万细胞胞体发出的神经末梢位于从真皮/表皮边界到表皮层的几微米之外，而且胶质细胞是其唯一的胞质性鞘膜。神经纤维和施万细胞被一层厚的纤维性胶原所包围。与其他胶原不同，这些胶原的方向与胶质-神经复合体的方向一致。这种形态特异的胶质细胞表达丰富的I 型水通道蛋白 (AQR-1)，并与CGRP+、P2RX3+、TRPV1+伤害性感受纤维共标。免疫电镜观从超微结构上证实，Sox10-TOM 小鼠的TOMATO 红色荧光存在于胶质细胞中。因此，一种形态上和分子上特化的施万细胞（以下称为伤害性施万细胞）在皮下边缘层形成网状结构，通过与伤害性神经纤维的密切联系构成胶质-神经复合体，并通过胶原纤维的结构包绕而相互绝缘。

为了确定伤害性施万细胞是否介导疼痛的感知，研究者首先分析了Plp-YFP、Sox10-TOM 和Sox2-TOM 小鼠中伤害性施万细胞在不同胶质细胞中的分布。Plp-YFP 和Sox10-TOM 小鼠的荧光表达在伤害性施万细胞以及梅氏小体、毛囊刺样结构的终末施万细胞和神经纤维的胶质细胞中，但不在默克尔细胞或背根神经节神经元外面的胶质细胞中表达。相比之下，Sox2-TOM 小鼠的荧光不表达在伤害性施万细胞中，但是表达在其他Sox10-TOM 小鼠表达的胶质细胞和默克尔细胞中。因此，将这些小鼠与携带光敏感通道的小鼠杂交，所得到的杂交小鼠就可以被用于以下实验：在不直接刺激感觉神经的情况下操控施万细胞的活动，从而特异性地研究伤害性施万细胞的功能。

将Plp 和Sox10 小鼠与ChR2-eYFP 小鼠交配获得Plp-ChR2 和Sox10-ChR2 小鼠，目的是通过光遗传的方法观察激活伤害性施万细胞是否足以引起疼痛样反应。随着刺激功率的增加，两种品系小鼠均有轻度肢体回避行为。手掌部神经的细胞外记录显示，神经放电活动随着刺激手掌部皮肤的光强增加而增加，所记录到的放电包括C 纤维的放电，也可能包括高振幅的A 类纤维簇状放电。低阈值机械感受器 (LTMRs) 末端为毛囊的刺样结构，可支配默克尔细胞和梅氏小体，引起头发弯曲、触摸、压力、颤动或振动，但不引起疼痛行为。然而在慢性疼痛中，轻触激活的神经元可导致触诱发痛。与表现出刺激强度依赖的缩足反应的Sox10-ChR2小鼠相比，刺激Sox2-ChR2 小鼠LTMR 的施万细胞不能引起小鼠缩足反应，说明LTMR 的施万细胞不参与痛行为。光刺激小鼠还引起舔爪、抖动和护足等行为，说明该缩足反应的确是痛行为。

为了研究伤害性施万细胞调节感觉的模式，研究者将诱发动物行为的光遗传阈下刺激，与冷、热和机械刺激相结合。这时，阈下光刺激可以使生理刺激所调节的行为变得敏感。阈下刺激显著增加了2 g von Frey 的行为反应；提高了Plp-ChR2 和Sox10-ChR2 小鼠对冷刺激的反应；但不影响棉签引起的轻触反应。在Sox10-ArchT 小鼠中，沉默伤害性施万细胞不影响冷刺激的反应。在Plp-ChR2和Sox10-ChR2 小鼠，阈下光刺激增强了热诱发缩足反应，但在Sox10-ArchT 小鼠沉默伤害性施万细胞并不影响热痛阈。通过增加阈下光刺激的时长，Plp-ChR2 小鼠的机械痛阈值表现出时间依赖性降低。在Sox10-ChR2 小鼠，沉默施万细胞导致机械阈值显著升高，24 h 后则恢复。

采用全细胞膜片钳技术对表达Sox10-TOM 的伤害性施万细胞电学性质进行检测。

当向细胞内注入步阶电流时，该细胞I-V 曲线在静息膜电位周围显示出双相线性关系，且在静息电位周围存在一个精确的拐点（静息电位平均-32.56±1.36 mV）。该类细胞呈现去极化时阻抗降低，表明有内在的离子通道打开，可将膜电位拉向静息电位。被动膜电学特性表明该细胞具有在神经元的范围内较慢的时间常数。

研究者还测量了伤害性的施万细胞对机械刺激的电反应，以确定其是否具有机械活性。研究显示，机械刺激可以使细胞产生瞬时的去极化(n = 9)。 其中4 个细胞可能由于机械力影响细胞的封接而没有完全回到基线。剩余的5 个细胞中，在持续施加力的过程中细胞放电的衰减基本上是完全的，这表明机械感受性反应在持续力的作用下产生了适应。由于反应和适应都非常迅速，使随后的刺激出现和前一个刺激类似的反应。这些细胞放电可以跟随实验者所给的最高刺激频率(60 Hz)。此外，释放机械力也可使细胞去极化，因此伤害性施万细胞对力的正负变化都有反应，但对持续的力反应要弱得多。伤害性施万细胞放电峰值平均幅度25.5±2.1 mV，半波宽6.7±1.5 ms，上升时间1.4±0.2 ms。机械感受器电位的这个时程说明有机械感受器电流产生的可能。因此这些参数提示伤害性施万细胞存在类似于之前描述的感觉神经元所属的快的门控机制。

4. 讨论

该研究为一种可以在皮肤上形成感觉器官、引起疼痛感觉的特殊类型的胶质细胞提供了证据。该研究表明伤害性施万细胞在表皮下的神经周围形成网状的胞质鞘，呈放射状突起进入与无髓鞘伤害性神经邻接的表皮。伤害性施万细胞相当于45 年前被忽略的位于表皮下边界的Remak 施万细胞。而在当时人们认为神经纤维失去了胶质附着，以游离神经末梢的形式进入表皮。在这篇文章中，研究者证明伤害性施万细胞具有高度的机械敏感性，对正和负的机械力刺激都有反应，与秀丽隐杆线虫的“开-关”式机械感受器反应相似，可将伤害性刺激转为电信号然后再转化为类似疼痛的行为。皮肤中的伤害性神经末梢也会对各种有害刺激产生反应。因此，伤害性神经和伤害性施万细胞形成一个伤害性胶质-神经复合体，这个复合体有两种感觉受体细胞类型：胶质细胞和神经细胞，都可能影响痛觉。大多数或所有类型的伤害性感受器似乎都参与了胶质-神经复合体的活动，而且在功能获得性 (gain of function) 实验中，机械性痛觉和热痛觉都增强了。然而，在功能丧失性 (loss of function) 实验中，小鼠的热痛觉并不受影响，推测初级传入神经本身就有足够的温度敏感离子通道的激活，或者伤害性施万细胞参与了研究者在实验中没有捕捉到的其他温度敏感性行为。与温度敏感性行为相反，小鼠机械阈值在功能性增加和功能性丧失的实验中都受到了影响，说明伤害性施万细胞在生理上对机械刺激的感觉起作用，这可能提示不同的伤害性神经元类型的反应谱比分子谱预测得更为广泛。如果不同的神经和神经胶质细胞传导不同的温度和机械刺激，如已知的默克尔细胞传导非伤害触觉，那么研究者的发现具有广泛功能上的意义。

（Abdo H, Calvo-Enrique L, Lopez JM, et al. Specialized cutaneous Schwann cells initiate pain sensation. Science, 2019, 16, 365:696-699. 上海交通大学医学院附属同仁医院，王婷婷 译, 同济大学医学院，张玲 校）