薰衣草茎叶中几种有机酸的含量测定

谭周倩，钱 骅，黄晓德，韩凯乐，杨建新，赵伯涛

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211111； 2.新疆伊犁紫苏丽人生物科技有限公司，新疆维吾尔自治区 伊宁 835000)

薰衣草(LavandualaangustifoliaMill)是唇形科薰衣草属植物，其传统利用是由薰衣草的花穗中提取精油，但目前对薰衣草茎叶研究和利用较少，未能充分体现薰衣草资源的价值。薰衣草茎叶生物量较大，且含有挥发油和有机酸、黄酮类[1-5]等功能成分，薰衣草中的有机酸中主要为熊果酸、齐墩果酸、绿原酸和迷迭香酸。熊果酸和齐墩果酸为五环三萜酸类化合物，互为同分异构体，具有相同或相似的生物活性，现已证实熊果酸和齐墩果酸具有抗肿瘤、抗炎、护肝、抗氧化、抗病毒、降血脂、降血糖、抗菌等药理作用[6-16]。迷迭香酸和绿原酸为酚酸类化合物，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和抗炎以及治疗代谢类疾病等药理作用[17]；迷迭香酸具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗过敏等药理作用[18]。本研究在前期研究薰衣草茎叶精油含量和成分的基础上[19]，进一步对薰衣草茎叶中有机酸类成分进行分析研究，以期为薰衣草资源利用途径拓展和综合利用开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

薰衣草茎叶(产于新疆维吾尔自治区伊犁地区) 由伊犁紫苏丽人生物科技有限公司提供；熊果酸(标准品，质量分数≥98%)、齐墩果酸(标准品，质量分数≥98%)、绿原酸(标准品，质量分数≥98%)、迷迭香酸(标准品，质量分数≥98%)， 上海阿拉丁生物科技股份有限公司；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)， TEDIA公司；乙醇(分析纯)、磷酸(分析纯)， 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅(XMTD203，江苏科析仪器有限公司)；水循环式真空泵(SHZ-Ⅲ，上海亚荣生化仪器厂)；电子天平 (FA2004，上海越平科学仪器有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent1200，美国Agilent公司)高速万能粉碎机(90G，江阴市药化机械有限公司)。

2 试验方法

2.1 标准品溶液的制备

称取熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸等标准品适量，分别精密称取10 mg并用无水乙醇溶解，分别定容于10 mL容量瓶中，充分摇匀，得到标准溶液，贴好标签并置于4℃冰箱保存备用。

2.2 色谱条件

2.2.1 熊果酸和齐墩果酸色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(84%)-0.17%磷酸水溶液(16%)，流速1 mL/min，检测波长210 nm，柱温30℃，进样量20 μL。

2.2.2 绿原酸和迷迭香酸色谱条件

色谱柱：安捷伦Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(13%)-0.34%磷酸水溶液(87%)，梯度洗脱，见表1所示，流速1 mL/min,检测波长330 nm，柱温30℃，进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures

2.3 标准曲线的制备

将熊果酸、齐墩果酸、绿原酸和迷迭香酸的标准溶液，稀释成浓度梯度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL的溶液，0. 45 μm微膜过滤，按照“2.2.1”的色谱条件进样。

2.4 样品制备

将薰衣草茎叶除杂干燥，粉碎，过20目筛，得薰衣草茎叶粉末，混合均匀，天平称取薰衣草茎叶粉末10 g，置于索氏提取器中，80%的乙醇，回流提取5h，提取液过滤，浓缩并定容，最后将其放在室温静置，取少量提取液，0. 45 μm微膜过滤，得到样品溶液，备用。

2.5 精密度试验

将“2.4”提取得到的样品溶液摇匀，0.45 μm微膜过滤，根据相应有机酸的色谱条件连续进样6次，得样品溶液中熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的峰面积，并且计算出有机酸的含量的相对标准偏差值，以评价仪器的精密度。

2.6 稳定性试验

将“2.4”提取得到的样品溶液摇匀，0.45 μm微膜过滤，根据相应有机酸的色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10 h进样，连续进样6次，得样品溶液中熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的峰面积，并且计算出以上几种有机酸的含量的相对标准偏差值，以评价样品溶液的稳定性。

2.7 重复性试验

精密吸取“2.4”样品溶液3份，0.45 μm微膜过滤，根据相应有机酸的色谱条件连续进样6次，得样品溶液中熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的峰面积，并且计算以上几种有机酸含量的相对标准偏差值，以评价方法的重复性。

2.8 回收率试验

准确吸取“2.4”条件下提取的已知熊果酸、齐墩果酸、绿原酸和迷迭香酸含量的样品液各1 mL，每个样6份，并加入以上已知含量的有机酸标准品1 mL，根据相应有机酸的色谱条件进行进样，测得熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的峰面积，计算平均加样回收率及相对标准偏差值。

2.9 含量的测定

吸取少量“2.4”的样品溶液，0.45 μm微膜过滤，根据相应有机酸的色谱条件进行进样。得到各个有机酸的峰面积，将其代入相应有机酸的标准曲线中进行计算，并按照式(1)计算薰衣草茎叶中有机酸的含量：

(1)

式中：C——根据标准曲线计算出总提取液中有机酸的浓度(mg/mL)；

V——样品溶液的体积(mL)；

M——薰衣草茎叶质量(g)

3 结果与分析

3.1 标准曲线

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。经过数据归纳和分析，峰面积与其质量浓度呈线性关系，得到熊果酸和齐墩果酸良好的线性回归方程，如图1所示，熊果酸的标准曲线为y=6 553.4x+41.58，R2=0.999 1；齐墩果酸的标准曲线为y=1 0661x-16.446，R2=0.999 4。经过数据的归纳和分析，峰面积与其质量浓度呈线性关系，得到绿原酸和迷迭香酸良好的线性回归方程。如图2，绿原酸的标准曲线为y=26 473x-74.194，R2=0.999 4；迷迭香酸的标准曲线为y=38 408x-44.289，R2=0.999 5。通过该结果，由此可知，当上述有机酸的进样浓度控制在0.05～0.8 mg/mL的范围时，其呈现的线性关系良好。

3.2 精密度结果

如表 2所示，测得熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的相对标准偏差分别为0.20%、1.59%、0.49%、0.34%，表明仪器精密度良好。

图1 熊果酸和齐墩果酸标准曲线Fig. 1 Standard curve of ursolic acid and oleanolic acid

图2 绿原酸和迷迭香酸标准曲线Fig. 2 Standard curve of chlorogenic acid and rosmarinic acid

表2 精密度实验结果

3.3 稳定性结果

如表3所示，测得熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的相对标准偏差分别为0.72%、1.90%、1.46%、1.69%，表明样品溶液24 h内稳定。

3.4 重复性结果

如表4所示，测得熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的相对标准偏差分别为0.48%、0.28%、0.54%、0.29%，表明该方法重复性良好。

3.5 回收率结果

如表5所示，熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的平均加样回收率分别为100.51%、99.70%、101.26%、99.11%，其相对标准偏差分别为2.09%、1.85%、1.64%、0.84%，该结果表明试验结果可靠。

表3 供试品溶液稳定性测定结果Table 3 Test results of test solution stability

表4 重现性测定结果Table 4 Results of reproducibility experiment

表5 加样回收试验结果Table 5 Test results of sample adding and recovery

3.6 含量测定结果

薰衣草茎叶中熊果酸、齐墩果酸、绿原酸和迷迭香酸含量测定结果如表6所示，熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸的含量分别为1.78%、0.34%、0.31%、0.48%。薰衣草茎叶中这几种有机酸含量顺序：熊果酸>迷迭香酸>齐墩果酸>绿原酸。

表6 有机酸含量Table 6 Comparison of organic acid content

4 讨论与结论

本研究利用HPLC法建立了同时测定熊果酸，齐墩果酸，绿原酸和迷迭香酸方法。通过精密度、稳定性、重复性、加样回收试验，确定仪器精密度良好、样品溶液稳定、方法可靠，为薰衣草茎叶中有机酸含量的测定确定了可行的方法。

本研究利用HPLC法对薰衣草茎叶中的绿原酸、迷迭香酸、熊果酸和齐墩果酸含量进行了测定。结果表明薰衣草茎叶中熊果酸含量较高，达到了1.79%，比现有提取熊果酸的植物原料中含量均高，而且薰衣草茎叶中迷迭香酸、齐墩果酸、绿原酸含量也比较高，分别为：0.48%、0.34%、0.31%。

熊果酸、齐墩果酸、绿原酸、迷迭香酸等有机酸因具有广泛的生物活性而备受关注。作为天然成分，上述几种有机酸广泛存在于各种植物中，但在各种植物中含量差异大，如相延英[20]等测定了常用中药中熊果酸和齐墩果酸含量，在所测的的11种药材中熊果酸含量在0.0137%～1.0065%之间，齐墩果酸含量在0.0203%～0.8028%；邹盛勤[21]等研究30种江西产植物中熊果酸的含量在0.106%～0.583%之间，目前制备天然熊果酸主要从枇杷叶和白花蛇舌草提取为主，齐墩果酸从女贞子中提取，绿原酸主要从金银花、绿咖啡等原料中提取得到，迷迭香酸主要从迷迭香叶中提取。因此，薰衣草茎叶完全可以作为熊果酸等有机酸提取物的原料进行开发利用，进一步研究薰衣草有机酸提取物作为植物生物刺激素、动物饲料添加剂[22]利用的可行性将拓宽薰衣草资源的利用途径，将有效提高薰衣草产业的经济效益，促进新疆薰衣草产业实现可持续发展。