嵌合抗原受体细胞疗法在皮肤T细胞淋巴瘤的应用

罗毅鑫，刘洁

皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma, CTCL)是一组原发于皮肤的T细胞来源的异质性恶性肿瘤，研究显示CTCL的发病率近年来呈上升趋势，威胁人类健康[1]。CTCL是第二大结外非霍奇金淋巴瘤，蕈样肉芽肿和Sezary 综合征是其中最常见的类型，约占所有CTCL的75%。其他类型CTCL包括淋巴瘤样丘疹病、原发性皮肤性间变性大细胞淋巴瘤(primary cutaneous anaplastic large cell lymphoma, C-ALCL)、成人T细胞白血病/淋巴瘤皮肤型(adult T-cell leukeamia/lymphoma, ATLL)、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)、外周T细胞淋巴瘤(peripheral T cell lymphoma, PTCL)中的原发性皮肤外周T细胞淋巴瘤等类型。早期CTCL治疗效果较好，但晚期 CTCL尚无有效的治疗方法。近年来，随着对CTCL发病机制及其肿瘤免疫学的深入研究，细胞免疫治疗成为研究热点。嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptors, CAR)疗法是细胞免疫治疗中的突出代表，在血液系统肿瘤如B细胞非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病等治疗领域中取得了富有前景的疗效[2]，在实体肿瘤如恶性胸膜间皮瘤、骨肉瘤、前列腺癌等广谱肿瘤亚型中CAR-NK细胞疗法也表现出很强的细胞毒性[3-4]。但由于CTCL发病肿瘤细胞的特殊免疫特性，CAR细胞疗法在CTCL治疗中的应用也具有一定的挑战性。CAR细胞疗法在CTCL中的应用目前仍处于基础研究阶段，尚未进入临床，但富有潜力，前景广阔。本文就国内外对于CAR细胞疗法在CTCL及少部分可出现继发皮肤表现的T细胞淋巴瘤和T细胞白血病中的研究进展及挑战做一综述。

1 CAR-T 细胞疗法

1.1 CAR-T细胞疗法的原理

CAR-T细胞治疗是通过基因工程技术，对T细胞进行基因修饰，嵌合进可识别肿瘤细胞的基因，使其表达能够识别肿瘤抗原的受体，即CAR。 CAR是单链抗体的可变区和T细胞信号分子的重组融合蛋白， 能够使T细胞通过非MHC限制性方式识别特异性抗原。CAR通常包含三个结构域：胞外结构域，跨膜结构域和胞内结构域。根据可识别特异性抗原的不同，CAR-T细胞可分为不同类型，如抗CD4 CAR-T细胞、抗CD5 CAR-T细胞和抗CD7 CAR-T 细胞等类型。改造后的T细胞就成为了CAR-T细胞，在体外扩增后，输入至患者体内，CAR-T细胞可靶向识别肿瘤细胞并进行清除，发挥治疗作用。如抗CD4 CAR-T细胞可识别表达CD4的肿瘤细胞并进行清除。CAR 技术将T细胞的免疫作用和识别肿瘤抗原的高亲和性相结合，使T细胞能特异性识别并杀伤肿瘤细胞,产生强大的免疫介导的抗肿瘤反应[5]。近期临床试验证实，CAR-T细胞疗法对难治性/复发性弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤具有较好的治疗效果[6]。 此外，针对黑色素瘤的CAR-T细胞疗法的临床前研究也正在进行[7-8]。

1.2 相关CAR-T细胞的种类与研究现状

1.2.1 抗CD4 CAR-T 细胞

CD4 抗原在大多数成熟T细胞淋巴瘤中均可表达。在成熟T细胞淋巴瘤中， 由于CD4不表达于造血干细胞，可减小抗CD4 CAR-T细胞在由造血干细胞分化而来的组织中的中靶-脱瘤效应。Pinz等[9]的研究显示， 在体外实验和 ALCL异种移植瘤小鼠模型中，抗CD4 CAR-T 细胞均可发挥抗肿瘤作用。 但正常T细胞也表达CD4, 使用抗CD4 CAR-T 细胞后，体内CD4细胞持续下降，可能造成严重的T细胞免疫缺陷。

1.2.2 抗CD5 CAR-T 细胞

在正常的成熟 T 细胞中，CD5 与CD28 和TCR/CD3有协同刺激作用[10-11]，参与人体正常的免疫功能。同时，CD5 也是一种能够在恶性 T 细胞中高表达的抗原[12-13]。Mamonkin 等[14]在研究中使用了含有 CD28 共刺激结构域的抗 CD5 CAR-T 细胞，此细胞在体外实验中能够清除恶性 T 细胞急性淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)细胞和 T 细胞淋巴瘤细胞，在 T-ALL 异种移植瘤小鼠模型中能够抑制肿瘤进展、消除部分瘤体，并且对正常 T 细胞仅存在有限、暂时的杀伤作用。Mamonkin 等[15]改进了抗 CD5 CAR-T 细胞，使用了条件表达的 4-1BB 作为共刺激结构域， 并证实改进后的 CD5 CAR-T 细胞能够完全消除 T-ALL 异种移植瘤小鼠的肿瘤。但 CD5 在某些恶性 T 细胞克隆中表达下调，存在肿瘤细胞抗原逃逸的可能性。

1.2.3 抗CD7 CAR-T 细胞

CD7 在正常组织中可表达于 T 细胞和NK 细胞，是急性 T-ALL 的主要标记物，也在部分 T 细胞淋巴瘤亚型中表达[12]。 Png等[16]的研究中，抗 CD7 CAR-T 细胞在经过蛋白表达阻滞剂修饰后，在 T-ALL 细胞系和异种移植瘤模型中，均显示出抗肿瘤作用。另一种使用CRISPR/Cas9技术敲除CD7基因的抗 CD7 CAR-T 细胞研究中[17]，此抗 CD7 CAR-T 细胞可以正常增殖、避免自我杀伤行为，且在体外仍显示出了抗病毒能力，目前已有使用抗 CD7 CAR-T细胞治疗T细胞白血病和 T 细胞淋巴瘤的Ⅰ期临床试验。近期研究中，使用 CRISPR/Cas9 技术同时敲除 TCRα和 CD7 基因的抗 CD7 CAR-T 细胞未出现自我杀伤，并且在 T-ALL异种移植瘤小鼠中可发挥抗肿瘤作用，同时不引起异种移植物抗宿主病[18]。

1.2.4 抗CD30 CAR-T细胞

CD30 能够在间变性大细胞淋巴瘤和 T-ALL 中表达[19-20]。目前关于抗 CD30 CAR-T 细胞的研究主要集中于霍奇金淋巴瘤。在 Carlos 等[21]的研究中，1 例皮肤型 ALK-ALCL 患者对抗 CD30 CAR-T 细胞治疗无反应；1例系统型 ALK+ALCL患者接受抗 CD30 CAR-T细胞疗法后，病情出现了9个月的完全缓解， 研究中所有患者均未出现病毒特异性的免疫损害。

1.2.5 抗CCR4 CAR-T 细胞

趋化因子受体CCR4在T-ALL、PTCL和CTCL的肿瘤 T 细胞中大量表达，可使肿瘤T细胞向皮肤归巢。Perera等[22]的研究已经证实，体外实验中，抗CCR4 CAR-T细胞能够溶解多种 T 细胞系；在 T-ALL 异种移植瘤小鼠模型中，能够清除瘤体。此外，由于具有免疫抑制作用的 Treg 细胞也表达CCR4， 抗CCR4 CAR-T细胞也能同时靶向并清除 Treg 细胞，增强抗肿瘤作用。

1.2.6 抗CD37 CAR-T 细胞

CD37 在 B 细胞和 T 细胞肿瘤中均表达[23]。近期关于抗 CD37 CAR-T 细胞的研究证实，抗 CD37 CAR-T 细胞能够清除包括皮肤T细胞淋巴瘤细胞系HUT 78在内的数种 T 淋巴瘤细胞系，并且未出现大量的自我杀伤现象。但仍需要进一步的体内实验和临床试验数据来支持 CD37 作为CAR-T 细胞靶标的潜力及可行性。

1.2.7 抗TRB CAR-T 细胞

T 细胞受体β链恒定域 (T cell receptor beta-chain constant domain, TRB)也可作为 CAR-T 细胞的靶标。Maciocia 等[24]近期针对 1 型 TRB (TRBC1)恶性克隆的淋巴瘤设计出抗 TCRC1 CAR-T 细胞， 此类细胞可识别和清除体外培养的恶性 TRBC1+细胞,保留 TRBC2+细胞，并且在T细胞白血病小鼠模型中具有抗肿瘤作用。TRBC2+T细胞的保留有利于患者维持机体T细胞相关的免疫功能。目前有抗TRBC1 CAR-T细胞的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行。除 TRBC1 外，也出现了针对 TRBC2 恶性克隆的T细胞淋巴瘤的 CAR-T 细胞研究，为Ⅱ型 TRB 恶性克隆的T细胞淋巴瘤患者提供了新的治疗希望[25]。

1.3 CAR-T细胞疗法的挑战及应对

1.3.1 中靶-脱瘤效应

由于正常T细胞或者未成熟T细胞和肿瘤细胞具有共同的CAR-T细胞识别的抗原，正常T细胞也被CAR-T细胞清除，造成T细胞发育不良或T细胞减少，出现严重的免疫缺陷。可通过以下方法改善：在制备CAR-T细胞时，选择能够精准靶向肿瘤细胞的特异性抗原。使用在体内存活时间相对短或者存活时间可以调控的CAR-T细胞，避免造成大量及持续的T细胞发育不良或T细胞缺失导致的严重免疫缺陷。也可以运用基因编辑技术在制备CAR时，插入安全稳定的可调控细胞死亡的基因片段[4]。此外，还可使用造血干细胞移植来缓解CAR-T细胞疗法造成的免疫缺陷。

1.3.2 自我杀伤现象

CAR-T细胞能够识别特异性抗原，同时其自身也表达此种抗原。因此，CAR-T细胞之间可相互识别，然后出现相互攻击、自我杀伤。目前应对此现象的方法有：使用基因编辑技术，敲除或者下调CAR-T细胞表面的特异性抗原的表达；在制备CAR-T细胞时，选择CAR-T细胞表达下调甚至不表达的特异性肿瘤抗原作为识别抗原；选择NK细胞制备CAR细胞。

1.3.3 制备CAR细胞时出现肿瘤细胞的污染

由于在制备CAR-T细胞时，正常的T细胞中混入了肿瘤T细胞，导致这些肿瘤T细胞也表达可以识别肿瘤抗原的CAR, 形成CAR-T细胞的污染，可造成疾病复发。可以通过使用异源性T细胞备制CAR-T细胞或使用NK细胞备制CAR细胞进行解决[26]。

1.3.4 细胞因子释放综合征

CAR-T细胞疗法的不良反应主要为细胞因子释放综合征(Cytokine release syndrome,CRS)，是CAR-T细胞治疗过程中常见的可致死的并发症。CSR指CAR-T细胞和肿瘤相关抗原在体内结合以后，会活化并释放大量细胞因子入血，导致发热、低血压、凝血障碍、神经毒、急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭等表现，严重者可导致死亡，需要高度警惕。进行治疗时要对输注的CAR-T细胞进行严格限制，使用支持疗法及细胞因子拮抗剂如IL-6阻断剂进行治疗[27]。

2 CAR-NK 细胞疗法

CAR-NK细胞疗法的基本原理与CAR-T细胞疗法相似，都是使用够识别肿瘤抗原的CAR。不同的是，CAR-NK细胞疗法是使用NK细胞。相比 CAR-T 细胞疗法，在 CTCL 中使用 CAR-NK 细胞疗法具有独特的优点：NK 细胞是固有免疫系统的重要组份，可作用于效应细胞，无需 HLA 匹配，不发生移植物抗宿主病，由于 NK 与 T 细胞共同抗原较少，CAR-NK细胞在发挥杀伤作用时可大大减少杀伤普通T细胞的情况，中靶脱瘤效应减少，通常不会引起CSR[28]。但CAR-NK细胞的寿命比较短，可能会影响对肿瘤细胞的持续杀伤能力。同时，由于CAR-NK细胞疗法目前研究多局限于实体肿瘤，其不良反应和应用问题还需要更多研究进行探索。另外，NK细胞分为不同亚群，存在表型和功能的差异，不同亚群的NK细胞对CAR-NK细胞疗法是否造成影响，也有待探索。

Chen 等[29]报道了抗 CD3 CAR-NK 细胞，可杀伤 T-ALL 细胞系及 PTCL患者原代肿瘤细胞，可抑制 T 细胞淋巴瘤异种移植瘤小鼠的瘤体生长并延长小鼠的生存期。靶向CD4的CAR-NK细胞也可杀伤CD4 T细胞白血病细胞、淋巴瘤细胞和患者原代肿瘤细胞，减小相关异种移植瘤小鼠模型的瘤体和延长小鼠生存期[30]。抗CD5 CAR-NK细胞疗法也在T-ALL及PTCL的相关体外实验及动物模型中被证实具有抗肿瘤作用[31]。

3 结语

综上所述，CAR细胞疗法在 CTCL中的应用目前仍处于基础研究阶段，尚未进入临床，仍面临诸多挑战，需要足够的临床前研究及临床试验数据来验证其疗效及安全性。但随着基因编辑技术、免疫学、分子生物学的不断发展，CAR细胞疗法也在不断被优化及改进。CAR细胞疗法为CTCL的治疗提供了新的思路和方向，带来了新的希望。