重组枯草芽孢杆菌异源分泌表达麦芽三糖酶及其发酵优化

楼志华

摘 要：为了实现麦芽三糖酶的商业化生产，本研究以枯草芽孢杆菌为宿主，构建了木糖诱导分泌表达载体，表达了来源于Thermobifida fusca NTU22的麦芽三糖酶基因，考察重组枯草芽孢杆菌表达麦芽三糖酶的能力。摇瓶验证了基因的功能表达之后，经过初步优化，最大发酵酶活为（108.4±2.84）U·mL-1。该研究为重组枯草芽孢杆菌发酵产麦芽三糖酶的工业化应用提供了参考。

关键词：枯草芽孢杆菌;麦芽三糖酶;分泌表达

Abstract：In order to realize the commercial production of maltotriohydrolase， in this study， Bacillus subtilis was used as the host to construct a xylose-inducing secretion expression vector and express the maltotriohydrolase gene derived from Thermobifida fusca NTU22. The ability of recombinant Bacillus subtilis to express maltotriase was investigated. After the shake flask verified the functional expression of the gene， after preliminary optimization， the maximum fermentation enzyme activity was （108.4±2.84） U·mL-1. This research provides a reference for the industrial application of recombinant maltotriase produced by Bacillus subtilis fermentation.

Key words：Bacillus subtilis; Maltotriohydrolase; Secreted expression

中图分类号：TQ925.1

麦芽三糖酶（Glucan 1，4-alpha-maltotriohydrolase），也叫麦芽三糖淀粉水解酶，可以从淀粉多糖的非还原末端连续地切割麦芽三糖残基，其主要水解产物麦芽三糖在糖果行业、饮料行业、食品加工行业有着广泛的应用[1]。目前，研究发现的麦芽三糖酶基因主要来源于蛾微杆菌（Microbacterium imperiale）[2]、灰链霉菌（Streptomyces griseus）[3]等，然而对于如何实现该酶的规模化、商业化生产鲜见报道。因此，麦芽三糖酶的高效生产菌种亟待开发，以实现麦芽三糖规模生产。

枯草芽孢杆菌是美国食品和药品管理局、中国农业农村部认证的食品安全菌株，广泛应用于生产各种工业酶制剂[4-5]。本研究拟构建木糖诱导的枯草芽孢杆菌表达系统，对来源于Thermobifida fusca NTU22的麦芽三糖酶基因序列优化后进行异源分泌表达，并对构建的重组枯草芽孢杆菌进行发酵条件优化，为枯草芽孢杆菌发酵生产麦芽三糖酶的工业化应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

敲除了α-淀粉酶基因amyL的枯草芽孢杆菌模式菌株Bacillus subtilis WB600、E. coli JM109、E. coli JM109/pBSxyl、E. coli JM109/pBSG3，均购于江南大学。

1.2 工具酶、引物和試剂

Taq和Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购于Thermo Fisher公司，各种限制性内切酶、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购于TAKARA有限公司。

1.3 DNA操作技术

质粒提取、DNA片段纯化、回收等均参照TAKARA试剂盒说明书，PCR扩增反应、DNA琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接以及转化子筛选等均参照分子克隆实验指南[6]。

1.4 重组枯草芽孢杆菌的构建

LBY培养基过夜培养E. coli JM109/pBSxyl、E. coli JM109/pBSG3，提取重组质粒pBSxyl、pBSG3后，按文献[7]所述方法将其转入敲除了α-淀粉酶基因amyL的B. subtilis WB600，从而获得重组枯草芽孢杆菌，分别命名为BSXYL和BSG3。

1.5 麦芽三糖酶酶活定义及测定

麦芽三糖酶酶活检测方法参考文献[8]。酶活单位（U）定义为：在pH 6.0、55 ℃的反应条件下，每分钟水解1%可溶性淀粉生成相当于1 μmoL麦芽三糖所需的酶量。

1.6 发酵优化实验

LBY培养基、发酵培养基以及微量元素配制方法参照文献[9]。在进行发酵优化实验时，均使用挡板摇瓶发酵，发酵时均加入终浓度为20 mg·L-1的四环素。初始pH为7.0，温度37 ℃，在适当时间添加木糖进行诱导。

2 结果与分析

2.1 重组表达载体的构建

NCBI显示，Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖酶基因序列总长为1818 bp，含木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因、信号肽的基因片段长度约为1507 bp。重组质粒经XbaⅠ和KpnⅠ酶切后应获得大小为1522 bp和6789 bp的两条核酸条带，电泳鉴定结果符合预期（图1），结合测序结果，表明重组表达载体构建正确。

2.2 重组麦芽三糖酶的表达

将对照菌BSXYL和重组表达菌株BSG3分别进行摇瓶发酵，接种后8 h均加入10 g·L-1木糖进行诱导，然后继续培养30 h，离心后收集发酵液上清，分别检测二者胞外麦芽三糖酶活力。结果显示，只有重组表达菌株BSG3检测到活力，而对照菌BSXYL未检测到活力。蛋白电泳（图2）结果显示在约68.7 kDa处出现一明显的表达条带，表明枯草芽孢杆菌成功地分泌了麦芽三糖酶到发酵液中[10-11]。

2.3 发酵条件优化

2.3.1 诱导剂添加时间对发酵的影响

分别在发酵培养至4、8、12、16 h添加10 g·L-1木糖进行诱导，然后继续发酵至48 h结束，诱导剂不同添加时间对重组菌表达麦芽三糖酶的影响如图3所示。

如图3所示，发酵结束时，OD600基本随着诱导剂添加时间的延迟而增加，这表明添加诱导剂的时间越早，越不利于重组菌的生长。而且在4～12 h，诱导剂添加越晚，发酵结束时检测到的胞外酶活也越高，当发酵12 h添加诱导剂时，发酵结束时可以检测到最高的胞外酶活（69.2±1.67）U·mL-1。

2.3.2 诱导温度对发酵的影响

分别考察25、30、37、42 ℃诱导对产酶的影响，结果如图4所示。可以发现，在25～37 ℃，随着诱导温度升高，发酵结束后的菌体量也越来越高，而42 ℃时，菌体量又有所降低，这说明重组菌最适生长温度为37 ℃。同时，在25～37 ℃，随着诱导温度升高，胞外酶活力逐渐增加，诱导温度37 ℃时，检测到最高胞外酶活力可达（71.6±2.31）U·mL-1。

2.3.3 发酵时间对发酵的影响

在前述实验结果基础上进行发酵，当培养至12 h时，添加10 g·L-1木糖进行诱导，同时添加20 g·L-1麦芽糊精，发酵至24 h时补加20 g·L-1葡萄糖，发酵至36 h时添加20 g·L-1葡萄糖和10 g·L-1木糖，以后每隔12 h补加10 g·L-1葡萄糖，继续发酵至96 h结束发酵。诱导后，每隔12 h检测菌体量OD600和麦芽三糖酶酶活，结果如图5显示。可以看到，发酵至72 h时，胞外检测到的最大酶活为（108.4±2.84）U·mL-1，之后酶活力明显开始下降，表明重组菌发酵应在其稳定期结束时停止发酵。

3 结论

本研究以枯草芽孢杆菌为宿主，研究了来源于Thermobifida fusca NTU22麦芽三糖基因的表达方法，并且成功地实现了该酶的木糖诱导分泌表达，能够在发酵液上清中检测到酶活力，而且所表达蛋白大小符合理论值。对重组菌进行了发酵条件优化，获得了最佳的发酵条件：在对数生长前中期添加诱导剂，诱导温度37 ℃，发酵至稳定期结束停止发酵，胞外检测到的最大酶活为（108.4±2.84）U·mL-1。

参考文献：

[1]徐贵华，刘钟栋，陈肇锬.小麦淀粉制备麦芽三糖的研究[J].河南工业大学学报（自然科学版），2002，23（3）：1-4.

[2]Takasaki Y，Kitajima M，Tsuruta T，et al. Studies on enzymatic production of oligosaccharides. Part VI. Maltotriose-producing amylase from Microbacterium imperiale[J]. Agricultural and biological chemistry，1991，55（3）：687-692.

[3]吴春森.麦芽三糖酶催化作用机制及其应用研究[D].无锡：江南大学，2017.

[4]Nakakuki T，Azum K，Kainuma K. Action patterns of various exo-amylases and the anomeric configurations of their products[J].Carbohydrate Research，1984，128（2）：297-310.

[5]Yang C H，Liu W H. Purification and properties of a maltotriose-producing alpha-amylase from Thermobifida fusca[J].Enzyme & Microbial Technology，2004，35（2-3）：254-260.

[6]Takasaki Y，Kitajima M，Tsuruta T，et al. Maltotriose-producing Amylase from Microbacterium imperiale[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan，2006，55（3）：687-692.

[7]Yang C H，Huang Y C，Chen C Y，et al. Heterologous expression of Thermobifida fusca thermostable alpha-amylase in Yarrowia lipolytica and its application in boiling stable resistant sago starch preparation[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2010，37（9）：953-960.

[8]Olempska-Beer Z S，Merker R I，Ditto MD，et al.Food-processing enzymes from recombinant microorganisms——a review[J].Regul Toxicol Pharmacol，2006，45（2）：144-158.

[9]池亞斌.枯草芽孢杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖条件优化控制研究[D].无锡：江南大学，2016.

[10]Tuan-Anh T，Ly L T，Viet N Q，et al. Novel methods to optimize gene and statistic test for evaluation - an application for Escherichia coli[J]. Bmc Bioinformatics，2017，18（1）：100.

[11]杨韵霏，李由然，张梁，等.细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达[J].微生物学通报，2017，44（2）：263-273.