疣粒野生稻体细胞杂交后代Y73快繁技术

严成其，赵硕，吕嘉城，王颖，陈磊，黄迪，谭晓菁，王栩鸣，周洁，杨勇，鲁宇文，黄坚，王芳，王俊敏，张志祥*

(1.宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040； 2.宁波惠贞书院，浙江 宁波 315030； 3.宁波五乡中学，浙江 宁波 315010；4. 浙江省农业科学院 农产品质量安全危害性质因子与风险防控国家重点实验室，浙江 杭州 310021)

疣粒野生稻(Oryzameyeriana)是我国现存的3种野生稻之一，经鉴定对白叶枯的抗性达到高抗，接近免疫，其抗性持久稳定，是最为理想的抗病育种材料[1-2]。疣粒野生稻染色体组型为GG，而栽培稻染色体组型为AA，使用常规的有性繁殖难以打破其生殖隔离的障碍，是利用其优异性状的巨大难点[3]。为了充分利用疣粒野生稻资源，课题组通过采用疣粒野生稻和栽培稻体细胞杂交的方法获得其体细胞杂交后代，从而实现疣粒野生稻遗传物质向栽培稻的定向转移工作。该试验为挖掘具有自主产权的高产抗病、优质抗逆等多项优良品种的水稻资源奠定试验基础。

试验研究中由于缺少遗传背景一致的疣粒野生稻体细胞杂交后代，难以进行抗病虫基因研究和新种质的繁育研究。组培快繁技术因其增殖速度快，生产周期短，繁殖系数高等优点，可在短期内实现遗传性一致的疣粒野生稻体细胞杂交后代规模化生产[4-5]。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料疣粒野生稻体细胞杂交后代Y73来源于宁波市农科院生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 材料的收集与消毒

取疣粒野生稻体细胞杂交后代Y73种子，经70%乙醇消毒30 s，在0.1%升汞中摇动消毒8 min，并用无菌水冲洗3～5次。

1.2.2 Y73愈伤组织的诱导和胚性细胞的形成

取消毒后的疣粒野生稻体细胞杂交后代Y73种子置于诱导培养基上诱导愈伤组织生成。通常每隔20 d挑选胚性愈伤组织或质量好的愈伤组织进行继代培养。预培养、诱导愈伤和继代培养基使用MS+2.4-D 0.5～3.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.00 mg·L-1，诱导培养基的培养条件为温度(25±2)℃，黑暗培养，适量增加糖、琼脂的浓度和添加谷氨酰胺。部分非胚性愈伤组织能诱导胚性愈伤组织。

1.2.3 胚性细胞分化成绿苗

将诱导出的胚性细胞接种在MS+NAA 0.5～4.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.50 mg·L-1+KT 1.5～2.0 mg·L-1分化培养基中，培养条件为温度(25±2)℃，光强2 000～3 000 lx、光照16 h·d-1。

1.2.4 小苗生根培养

将由胚性细胞分化成的小苗接种在1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1生根培养基中，置于25 ℃、光照强度2 000 lx、光照时间16 h·d-1的环境中培养，30 d后统计植株生长情况，包括植株高度、叶片数、根数等。

1.2.5 炼苗及移栽

待绿苗在培养基中长至10 cm后，直接打开培养瓶盖，加入少量纯净水，水量以高过培养基2 cm为宜，定时观察续水，14 d后用温水将绿苗充分洗净，然后置于内含1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1水溶液的三角瓶中，14 d后移栽到苗床。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织诱导和胚性细胞的形成

由表1可知，将疣粒野生稻体细胞杂交后代的种子接种到MS+2.4-D 0.5～3.5 mg·L-1+6-BA 0.01～2.00 mg·L-1诱导培养基中，部分愈伤组织可在30 d左右被成功诱导，初次诱导出的愈伤组织有些是非胚性的。若在继代培养基中提高糖和琼脂的浓度，同时添加谷氨酰胺，能使部分愈伤组织转变成小颗粒状的、易碎的胚性愈伤组织。

表1 不同培养基对诱导愈伤组织和胚性细胞的影响

在同一培养基继续培养2个月左右能诱导出胚性愈伤组织，继续培养可建成分散性好、色泽鲜黄、细胞质浓、分裂能力旺盛的胚性细胞。其中，胚性细胞诱导成功率最优的培养基配方是MS+2.4-D 1.5～2.5 mg·L-1+6-BA 0.1～1.0 mg·L-1，成功诱导率可达11.1%～14.2%。

2.2 不同培养基浓度对体细胞杂交后代胚性细胞再生成苗的影响

设10组含有不同浓度激素的MS培养基，每组培养基接30个胚性细胞，63 d后观察结果。表2表明，MS+NAA 1.5～2.0 mg·L-1+6BA 0.10～0.30 mg·L-1+KT 1.5～2.0 mg·L-1均可诱导成苗，成苗率可达到28.6%～40.7%。

表2 不同培养基浓度对胚性细胞再生成苗的影响

2.3 绿苗生根培养

将再生的小苗接种在1/2MS+IAA 0.01～0.03 mg·L-1培养基中，都能长出茎、根、叶完整的水稻植株，30 d后生根率达到91%。

2.4 炼苗及移栽

由于组培苗在形态和生理结构上与自然生长苗存在一定差异，为了适应移栽后的自然环境，炼苗显得尤为重要。植株炼苗过程将组培苗从异养逐步过渡到自养，由无菌环境变为有菌环境，温光条件也发生显著变化。本研究表明，炼苗7 d后的10～15 cm再生小植株直接移栽在保持湿度的苗床中，1周后成活率达到90%。

3 小结与讨论

水稻细胞的生长主要受大量元素、微量元素、激素、维生素、有机质、渗透压、稳定剂等影响。植物激素是影响诱导水稻愈伤组织和胚性细胞愈伤组织最关键因素，2.4-D是诱导愈伤组织最重要的关键激素成分。随着2.4-D浓度的升高，其愈伤组织生长加快，胚性减少。当2.4-D>3.5 mg·L-1或<1.0 mg·L-1时，都不利于水稻体细胞杂交后代的愈伤组织和胚性细胞愈伤组织的形成；6-BA<1.0 mg·L-1有利于胚性细胞的生长。已建成的胚性细胞愈伤组织中，继代时间过长其胚性减弱，表现为细胞团周边细胞变得粗糙，部分细胞团开始解体，形成不规则颗粒状突起，同时出现非胚性细胞愈伤组织[6]。愈伤组织的色泽、外表对再生频率均有一定影响，一般花菜形态、浅白色泽、结构紧密的胚性愈伤组织在合适的分化培养基中容易变绿，并长出绿芽。最初诱导出的愈伤组织，大多是非胚性的，若在继代培养基中添加谷氨酰胺400 mg·L-1，提高琼脂和糖的浓度分别大于10和35 g·L-1，并能使愈伤组织转变成易碎的小颗粒状的胚性愈伤组织[7]。胚性愈伤组织转接到合适量的含有细胞分离素和生长素的培养基中再生小苗，小苗在低浓度IAA减半基本培养基中长根。小植株在移栽之前必须经过炼苗，与其他植物组织培养苗不同，水稻小苗可以直接移栽至水稻土壤。