尿素包合法富集核桃油不饱和脂肪酸工艺优化

李泉岑 龙勇益 夷娜 王琼琼 王磊 李胜 白冰瑶 张丽

摘 要：本试验以新疆薄皮核桃油为原料，采用正交试验优化核桃油混合脂肪酸的皂化工艺及响应面法优化尿素包合法富集不饱和脂肪酸的工艺。得到核桃油混合脂肪酸皂化工艺的最优方案为皂化液浓度1 mol·L-1、皂化温度80 ℃、皂化时间4.5 h，在此条件下混合脂肪酸得率为75.58%;尿素包合法富集不饱和脂肪酸的最优工艺为包合时间20 h、包合温度-18 ℃、醇脲比5∶1、脲脂比2∶1，在此条件下不饱和脂肪酸得率为55.26%。

关键词：核桃油;尿素包合;不饱和脂肪酸

Abstract：In this experiment， the Xinjiang walnut oil as raw material， the saponification process of walnut oil mixed fatty acid was optimized by orthogonal test and response surface method was used to optimize the urea inclusion process of unsaturated fatty acids. The optimal scheme of the walnut oil mixed fatty acid saponification process is the concentration of the saponification solution was 1 mol·L-1， the saponification temperature was 80 ℃， and the saponification time was 4.5 h.

Under these conditions， the yield of mixed fatty acids was 75.58%. The optimal process for enriching unsaturated fatty acids by urea inclusion method is rates of urea and fatty acid was 2∶1， the rates of alcohol and urea was 5∶1， the inclusion temperature was -18 ℃， the inclusion time was 20 h. Under these conditions， the yield of unsaturated fatty acids was 55.26%.

Key words：Walnut oil; Urea inclusion; Unsaturated fatty acids

中圖分类号：TQ645.6

核桃油中含有大量人体所必需的不饱和脂肪酸[1-3]，

如亚油酸，亚麻酸等。不饱和脂肪酸可以有效降低人体的血压和血脂[4]、降低血清中胆固醇的含量、抗炎[5]、延缓衰老过程、预防疾病[6]、增进血液流通、预防动脉粥样硬化[7]、加速新陈代谢，并且对过敏反应也有一定的抑制作用[8]，具有重要的生理功能[9-10]。核桃油营养价值高，原材料易获得，且不饱和脂肪酸在保健品以及医药品中的重要作用逐渐显露出来，因此具有巨大的发展潜力。

不饱和脂肪酸富集方法有很多种[11-15]，其中尿素包合法因操作简单、成本较低、便于工业化生产等优点被广泛应用[16-18]。本实验以新疆薄皮核桃油选定为研究对象，富集方法选用尿素包合法，通过研究各因素对尿素包合效果影响的规律，找出最优提取工艺方案。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

新疆薄皮核桃油（实验室压榨法制取）;氢氧化钠、尿素、甲醇、无水硫酸钠、95%乙醇、石油醚（30～60 ℃）、

氯化氢、氯化钠，以上试剂均为分析纯。

SHZ-19 B循环水真空泵，天津市华兴科学仪器厂生产;RE-3000A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂生产;SG260E1榨油机，浙江苏泊尔股份有限公司生产;PHS-3E pH计，上海仪电科学仪器有限公司生产;LE-203E电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产;DZKW-D-2电热恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂生产。

1.2 实验方法

1.2.1 混合脂肪酸的制备

根据吴丽雅等的方法，称取10 g核桃油，缓慢加入到一定浓度的氢氧化钠乙醇溶液中加热回流，回流过程中加入蒸馏水，使皂化液充分溶解，将溶液移入分液漏斗，加入石油醚萃取，使醚层和水层分离，分离出的水层加入盐酸调节pH值至1～2，再次移入分液漏斗加入石油醚萃取，得到油层，加蒸馏水冲洗至中性，加入无水硫酸钠干燥过滤，用旋转蒸发仪旋蒸获得混合脂肪酸[19]。

1.2.2 不饱和脂肪酸的富集

根据刘旭等的方法，按一定比例将尿素和乙醇混合，加热回流至溶解后加入混合脂肪酸，继续加热一定时间后冷却，密封放入冰箱冷冻结晶，结晶后取出结晶物抽滤，滤液加蒸馏水多次洗涤，旋蒸除去乙醇，用盐酸调节pH至2～3，加入石油醚萃取出上层液，加蒸馏水于上层液调节至中性，用无水硫酸钠干燥过滤，旋蒸后得到不饱和脂肪酸[20]。

1.2.3 不饱和脂肪酸得率的计算

1.3 数据处理与统计分析

数据分析采用IBM SPSS Statistics 26进行方差分析，采用0.05水平。

2 结果与分析

2.1 皂化实验提取混合脂肪酸

2.1.1 单因素试验

（1）皂化液浓度对混合脂肪酸得率的影响。在皂化温度80 ℃、皂化时间5 h条件下，分别设置不同皂化溶液浓度，混合脂肪酸得率随皂化液浓度的变化如图1所示。

由图1可知，当皂化液浓度小于1 mol·L-1时，皂化液浓度增高，脂肪酸得率上升，当浓度高于1 mol·L-1

时，脂肪酸得率缓慢下降。这是因为皂化液可以促进皂化反应正向进行，当皂化液浓度高于1 mol·L-1时，会使溶液碱性增强，后面加入盐酸调pH时，由于溶液碱性太强，加入盐酸量会相应增大，可能会造成混合脂肪酸的损耗率增高，从而使混合脂肪酸得率

下降。

（2）皂化温度对混合脂肪酸得率的影响。在皂化时间5 h、皂化溶液浓度1 mol·L-1条件下，分别设置不同皂化温度，混合脂肪酸得率随皂化温度的变化如图2所示。

由图2可知，温度在80 ℃时，混合脂肪酸得率最高。随着温度升高，反应正向进行;当温度高于80 ℃

时，可能会发生其他的一些副反应，导致混合脂肪酸得率会降低。因此，皂化温度在80 ℃时混合脂肪酸得率最高。

（3）皂化时间对混合脂肪酸得率的影响。在皂化温度80 ℃、皂化溶液浓度1 mol·L-1条件下，分别设置不同皂化时间，混合脂肪酸得率随皂化时间的变化如图3所示。

由图3可知，皂化时间在5 h时，混合脂肪酸得率最高。当皂化时间高于5 h，得率下降。原因可能是開始反应时核桃油中的脂类物质与皂化液充分接触，使得脂类物质充分水解，当时间高于5 h，水解反应达到了一定的程度，继续反应将会使生成的皂化物逆向反应发生分解，使混合脂肪酸得率下降。所以最佳皂化时间为5 h。

2.1.2 正交试验

在上述单因素试验的基础上，运用软件正交设计助手Ⅱ3.1中的L9（34）正交表，选取皂化液浓度（A）、皂化时间（B）、皂化温度（C）3个因素进行考察，选取混合脂肪酸得率为考察指标，确定混合脂肪酸的提取工艺的最优方案。皂化工艺的正交试验水平见表1，皂化工艺的正交试验结果见表2。

由表2可以看出，各因素对混合脂肪酸得率的影响从大到小依次为A>C>B，含量最优组合为A2B1C2，即混合脂肪酸得率的最优方案为皂化液浓度1 mol·L-1、皂化温度80 ℃、皂化时间4.5 h。此条件下，混合脂肪酸的率最高。

2.1.3 验证试验

通过上述正交实验得到的最优方案进行3次试验，得到混合脂肪酸得率为75.58%，高于正交实验中的最好实验4号得率75.03%，进一步确证了皂化工艺的最优条件。

2.2 尿素包合实验提取不饱和脂肪酸

2.2.1 单因素实验

（1）包合时间对不饱和脂肪酸得率的影响。在脲脂比（尿素与混合脂肪酸的比值）为2∶1、醇脲比（乙醇与尿素的比值）为5∶1、包合温度-18 ℃的条件下，考察不同包合时间对不饱和脂肪酸得率的影响，结果如图4所示。

由图4可知，包合时间在20 h时，不饱和脂肪酸得率最高，高于20 h，得率下降。原因可能是包合时间少于20 h时，包合未达到饱和状态;反应进行到

20 h后，体系中的饱和脂肪酸被包合完全，继续反应，尿素可能包合不饱和脂肪酸，导致不饱和脂肪酸得率降低。所以，当包合时间在20 h时不饱和脂肪酸得率最高。

（2）包合温度对不饱和脂肪酸得率的影响。在脲脂比为2∶1、醇脲比为5∶1、包合时间20 h的条件下，分别设置不同包合温度，考察包合温度对不饱和脂肪酸得率的影响，结果如图5所示。

由图5可知，包合过程中温度太低，包合反应体系在还未包合完全的情况下就已经凝结，导致不饱和脂肪酸得率低。当温度超过-18 ℃后，温度升高会使尿素晶体的结晶量减少，不利于尿素结晶，且晶体的稳定性会变差导致不饱和脂肪酸得率降低。由此得出，在-18 ℃时，不饱和脂肪酸得率最高。

（3）醇脲比对不饱和脂肪酸得率的影响。在脲脂比为2∶1、包合温度-18 ℃、包合时间20 h的条件下，分别设置不同醇脲比，不饱和脂肪酸得率随醇脲比的变化如图6所示。

由图6可知，当醇脲比为5∶1时得率最高。这是由于乙醇用量太少时，尿素不能溶解充分，反应相中尿素浓度太高，不利于包和反应的正向进行，还有可能是当尿素包合完全混合脂肪酸的饱和脂肪酸后，会继续包合不饱和脂肪酸，导致不饱和脂肪酸的得率降低;当乙醇用量太多，尿素浓度太低，也不利于包合反应的进行。综合考虑，当醇脲比为5∶1时，不饱和脂肪酸得率最高。

（4）脲脂比对不饱和脂肪酸得率的影响。在醇脲比为5∶1、包合温度-18 ℃、包合时间20 h的条件下，分别设置不同脲脂比，不饱和脂肪酸得率随脲脂比的变化如图7所示。

由图7可知，当脲脂比为2∶1时得率最高。这是由于当尿素用量太大时，尿素包合完全混合脂肪酸中的饱和脂肪酸后，会继续包合不饱和脂肪酸，导致不饱和脂肪酸的得率降低，在脲脂比未达2：1时，由于尿素用量太少，会导致混合脂肪酸中的饱和脂肪酸未被包合完全，从而使得不饱和脂肪酸得率降低。

2.2.2 响应面试验

（1）响应面发优化提取工艺模型建立与分析。根据单因素试验结果，选取包合时间、包合温度、醇脲比、脲脂比为试验因素，评价指标为不饱和脂肪酸得率，使用Design-Expert 8.0.6软件中的Box-behnken进行响应面设计。尿素包合反应响应面试验因素水平见表3，尿素包合反应响应面设计方案及结果见表4，尿素包合反应回归方程方差分析见表5。

通过回归分析，得到各因素与不饱和脂肪酸得率的方程式为：

不饱和脂肪酸得率=55.11+1.40A-1.87B+2.01C+

1.90D-0.19AB+0.25AC-0.024AD+0.037BC+0.094BD-0.005CD-2.26A2-2.95B2-3.15C2-4.42D2。

根据表5得知，A、B、C、D以及A2、B2、C2、D2对不饱和脂肪酸得率的影响极显著，而交互项对其影响不显著（P>0.05）。由于其失拟项P值为0.406 2，不显著，可知该模型拟合度较好;决定系数R2和RAdj2分别为0.995 8和0.991 6，表明预测值和真实值之间有较高的相关性。由此可知，该模型可以反映不饱和脂肪酸得率的真实情况。根据F值可知，影响不饱和脂肪酸得率的各因素大小排序为：醇脲比>脲脂比>包合温度>包合时间。

（2）最佳提取工艺试验及验证。根据Design-Expert8.0.6给出的回归方程，得出包合时间20.68 h、包合温度-18.65 ℃、醇脲比5.33∶1、脲脂比2.11∶1为该试验的最优提取工艺，在此条件下，得出不饱和脂肪酸最高的率为56.18%。根据实际情况，采取包合时间20 h，包合温度-18 ℃，醇脲比5∶1，脲脂比2∶1的条件，重复3次试验，得出不饱和脂肪酸得率为55.26%±0.5%，与理论值（54.99%）较为接近，说明响应面法优化核桃油不饱和脂肪酸的方法较为合理，具有可行性。

3 结论

本研究以新疆薄皮核桃油为原料，运用尿素包合法对核桃油中不饱和脂肪酸进行富集，通过正交实验得出在皂化液浓度为1 mol·L-1，皂化温度为80 ℃，皂化时间为4.5 h的条件下，混合脂肪酸得率为75.58%，该工艺为核桃油混合脂肪酸皂化工艺的最优方案;通过响应面法得出在包合时间20 h，包合温度-18 ℃，醇脲比5∶1，脲脂比2∶1的条件下不饱和脂肪酸得率为55.26%，该工艺为尿素包合核桃油不饱和脂肪酸的最优方案。该工艺使用成本较低，设备简单，为日后核桃油不饱和脂肪酸富集的工业化生产奠定了一定的基础。

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