Th17/Treg失衡在2型糖尿病伴慢性牙周炎患者中的临床意义

王佳 宋向欣 苏旭 陈晓涛

2型糖尿病(diabetes mellitus type II，T2DM)占全部糖尿病的90%以上，其本质是一种与免疫系统激活密切相关的全身性低度慢性炎症状态[1]。牙周炎是糖尿病的第六大并发症[2]。慢性牙周炎(chronic peridontitis，CP)是发生于牙周支持组织的感染性疾病，T2DM与CP的双向关系在过去的几十年中得到了广泛的研究，二者都与炎症增强和免疫反应受损有关[3-4]。T辅助细胞17(T helper cells 17，Th17)/调节性T细胞 (regulatory T cells，Treg)平衡在多种炎症性和自身免疫性疾病中发挥重要作用，本研究通过检测健康人、单纯T2DM患者、T2DM伴不同程度牙周炎患者外周血中的Th17、Treg及其相关细胞因子的水平及与牙周状态的关系，初步阐明 Th17/Treg 细胞比例失衡在T2DM伴CP中的作用和意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 病例选择及分组 纳入2018 年5 月～2019 年5 月就诊于新疆维吾尔自治区人民医院患者共88 例，分为健康对照组(Ⅰ组)：随机抽取该院体检中心的健康志愿者21 例；单纯T2DM组(Ⅱ组)：收集在该院内分泌科住院确诊为单纯T2DM且未合并牙周炎的患者25 例，符合1999 年WHO关于2型糖尿病的诊断标准[5]；T2DM合并牙周炎组：收集该院内分泌科住院确诊的T2DM合并牙周炎患者，T2DM的诊断标准同上，CP的诊断标准符合2012 年美国CDC疾控中心制定的分类标准[6]，分为T2DM伴轻度牙周炎(Ⅲ组)22 例以及T2DM伴中重度牙周炎(Ⅳ组)20 例患者。受试者知情同意，研究方案经伦理委员会批准(编号： 国自然2016029)。

1.1.2 诊断标准 1999年WHO关于2型糖尿病的诊断标准[5]，即空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖(2hPG)≥11.1 mmol/L；根据2012 年美国CDC疾控中心关于CP的分类标准[6]，即轻度CP：≥2 个邻面位点CAL≥3 mm和≥2 个邻面位点PD≥4 mm(不在同一颗牙上)或1 个邻面位点(PD≥5 mm)；中度CP：≥2 个邻面位点CAL≥4 mm(不在同颗牙上)，或≥2 个邻面位点PD≥5 mm(不在同颗牙上)；重度CP：≥2 个邻面位点CAL≥6 mm(不在同颗牙上)和≥1 个邻面位点PD≥5 mm。因重度牙周炎病例数较少，本研究将中度与重度牙周炎，合并为中重度CP组。

1.1.3 纳入标准 ①口内余留牙不少于20 个；②近半年内未行牙周治疗，3 个月内未服用抗生素或非甾体类抗炎药物；③接受正规治疗，采用口服降糖药物或注射胰岛素治疗，近期病情无变化。

1.1.4 排除标准 ①合并严重的肝肾功能不全者；②合并感染性疾病；③恶性肿瘤患者；④自身免疫性疾病患者；⑤吸烟者(按WHO关于吸烟调查方法标准规定每天吸烟1支以上，持续吸烟1 年以上为吸烟者)。

1.2 主要试剂及仪器

抗人CD3、CD4、IL-17A、CD25、CD127单克隆抗体(Biolegend公司，美国)；佛波酯(PMA)、离子霉素(IO)、蛋白转运抑制剂(BFA)(Biogems公司，美国)；淋巴细胞分离液(天津华科生物有限公司)；人IL-17、TGF-βELISA试剂盒(R&D公司，美国)；FACS Canto TMII流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.3 方法

1.3.1 牙周指标检查 对全部受试者行牙周检查，每颗牙均做颊、舌侧的远中、正中和近中6 个位点记录，统一使用Williams牙周探针，检测PD、BI。6 个位点的PD和BI平均值即为每个牙的结果，受检牙的平均值即为患者的结果。同时拍摄曲面断层片，辅助诊断。

1.3.2 外周血中Th17、Treg水平的检测 分离PBMC：清晨空腹采集受检者外周静脉血4 ml，肝素抗凝，离心取血浆，-80 ℃保存待测。经Ficoll密度梯度离心分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。Th17检测：将PBMC转移至24 孔板中，使用刺激物佛波酯(PMA)和离子霉素(IO)1 h后，放入蛋白转运抑制剂(BFA)，放入37 ℃培养箱中培养4 h，刺激细胞活化，并设置同型对照组，然后标记CD3、CD4抗体，破膜孵育后标记IL-17A抗体，测定Th17细胞百分比。Treg检测：在PBMC中分别标记CD4、CD25、CD127抗体，避光孵育20 min后，PBS清洗，离心弃上清，重悬细胞，上流式仪器检测。

1.3.3 血清中IL-17、TGF-β检测 将血清按照酶联免疫吸附法(ELISA)说明书检测IL- 17、TGF-β，酶标仪测定450 nm 吸光度值，绘制标准曲线，计算细胞因子实际浓度。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 一般资料及临床参数

各组间年龄、性别均无统计学差异(P>0.05)，3 组间的糖尿病病程、收缩压、舒张压、 总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、体重指数(BMI)、25羟基维生素D测定均无统计学差异(P>0.05)。与Ⅰ组、Ⅱ组相比，Ⅲ组、Ⅳ组的PD、BI更高(P<0.05)，与Ⅲ组相比，Ⅳ组的PD更高(P<0.05)(表 1)。

2.2 外周血中Th17、Treg的变化

图 1A圈出部分表示淋巴细胞及CD3+CD4+T细胞亚群，图 1C表示淋巴细胞及CD4+CD25+T细胞亚群。与Ⅰ组相比，其他3 组中Th17细胞比例明显较高(P<0.05)，且Ⅳ组较其他3 组更高(P<0.05)(图 1B和l图 2A)；与Ⅰ组相比，其他3 组Treg细胞比例明显较Ⅰ组更低(P<0.05)，但3 组间无显著差异(P>0.05)(图 1D、图 2B)；与Ⅰ组相比，其他3 组Th17/Treg比值明显较Ⅰ组更高(P<0.05)，其中Ⅳ组较Ⅱ组的Th17/Treg比值更高(P<0.05)(图 2C)。

表 1 研究人群的临床和人口统计参数

图 1 每组中单个患者的Th17(CD3+CD4+IL-17A+), Treg(CD4+CD25+ CD127-) 细胞典型流式图

图 2 各组Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比值

图 3 各组IL-17、TGF-β水平

2.3 各试验组血清中 IL-17、TGF-β的变化

与Ⅰ组相比，Ⅲ组、Ⅳ组的 IL-17浓度更高(P<0.05)，且Ⅳ组的 IL-17浓度比Ⅱ组也更高(P<0.05)(图 3A)。而TGF-β的浓度各组间没有明显差异(P>0.05)(图 3B)。

2.4 Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17、TGF-β与 PD，BI的相关性分析

相关性分析发现Th17、Th17/Treg比值、IL-17与PD呈正相关(r=0.599 0、0.519 9、0.335 1，P<0.05)(图 4)，Th17、Th17/Treg比值、IL-17与BI呈正相关(r=0.288 6、0.296 2、0.267 4，P<0.05)(图 5)。

3 讨 论

大量研究证实，牙周炎和糖尿病之间存在双向关系，但其机制仍没有得到充分的阐述，越来越多的研究关注到牙周炎与糖尿病的免疫炎症反应机制。

图 4 Th17，Treg，Th17/Treg 与PD的相关性分析

图 5 Th17，Treg，Th17/Treg 与BI的相关性分析

CD4+淋巴细胞是构成机体免疫系统的主要细胞，在T2DM伴CP的发生发展中可能有重要作用。淋巴细胞可分为Th1/Th2两个亚群，Th17细胞是2005 年被新发现的一类有促炎作用CD4+T细胞亚群，特征性地分泌IL-17，而Treg对炎症和自身免疫则有抑制作用，Th17和Treg在炎症和自身免疫病中的作用相互拮抗[7]。本研究发现与健康对照组相比，其他3 组的Treg细胞比例均显著降低，说明T2DM患者免疫负调节的能力低于正常人，与李大伟等[8]的研究一致，但有无牙周炎对于T2DM患者的Treg细胞比例无显著影响。Treg细胞主要通过细胞依赖的抑制作用或者释放细胞因子如 IL-10、TGF-β等发挥抗炎作用[9]，本研究发现TGF-β浓度在T2DM患者与健康对照组间均没有明显差异，说明T2DM合并CP时没有明显的炎症抑制作用。与健康对照组和单纯T2DM组相比，T2DM伴中重度CP患者的Th17比例和Th17/Treg比值明显升高，说明T2DM合并中重度CP患者体内存在明显Th17/Treg失衡，而这种免疫失衡可能主要是由于炎症Th17细胞数量增高所致。与Zeng等[10]的研究一致，其认为Treg/Th17或Treg/Th1比例降低有助于免疫激活和炎症的增强，从而引起T2DM的并发症。说明了Th17/Treg免疫失衡在T2DM伴CP中的作用。

Th17可通过特异性分泌IL-17发挥促炎作用，IL-17是一种强有力的促炎细胞因子，与受体结合，可产生多种炎症介质，引起炎性细胞浸润和组织损伤[11]。本课题组前期研究证明了Th17/IL-17参与牙周炎的发生发展[12]，邓秋艳等[13]的研究表明IL-17可能是牙周炎发生重要促炎细胞因子，糖尿病可能通过Th17 细胞亚群共同发挥致病作用。本研究发现，与健康对照组相比，单纯T2DM组的Th17细胞比例及IL-17浓度明显升高，说明T2DM患者的高血糖状态可刺激IL-17等炎性因子的激活和释放，引起牙周组织破坏和牙槽骨吸收，而增加糖尿病患者牙周炎发生的可能性及严重性。T2DM伴中重度CP的Th17比例及血清中IL-17浓度明显升高，说明中重度CP加重了Th17 诱导的炎症反应，提示牙周袋内的IL-17可能通过牙周袋溃疡面进入血液循环，从而增加糖尿病的患病风险和血糖控制难度。本研究通过相关性分析发现Th17、Th17/Treg比值、IL-17与PD、BI均呈正相关(P<0.05)，说明牙周炎的严重程度与免疫失衡程度相关。与王建琪等[14]的研究一致，说明牙周炎患者机体免疫功能降低，IL-17与牙周炎发生发展相关。进一步证明了Th17/IL-17在T2DM和CP双向关系中的作用。

由此可以推测牙菌斑中的细菌及其产物作为始动因子可能触发机体的免疫反应，从而促使Th17细胞的分化并分泌IL-17，激活破骨细胞和分泌 MMPs，导致牙槽骨的吸收和结缔组织破坏；同时，IL-17与受体结合通过多种信号通路，可引起胰岛素抵抗，或在其他介质的协同作用下参与破坏胰岛β细胞，促进T2DM的发生发展。T2DM和CP两者互为因果，相互影响，形成恶性循环，而在这过程中Th17、Th17/Treg比值及IL-17发挥了重要作用。

本研究表明Th17/Treg失衡可能参与了T2DM伴CP的发生发展过程，表明了T2DM和CP之间的双向关系，也可能成为免疫治疗的潜在靶点。