TRAP促进卵巢癌免疫耐受及免疫治疗的研究进展

朱秀琳，蔡云朗

(东南大学附属中大医院 妇产科，江苏 南京 210009)

卵巢癌是常见的妇科肿瘤，早期病变隐匿，无明显的临床症状，给早期诊断带来困难；晚期有明显的侵袭性、高复发率以及对常规治疗的耐药性，缺乏有效的治疗方法，导致卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤的首位[1]。肿瘤微环境为肿瘤的生长迁徙提供适宜环境，主要由肿瘤细胞、肿瘤相关成纤维细胞(canceR-associated fibroblasts，CAFs)、肿瘤相关淋巴细胞、细胞外基质以及肿瘤血管系统构成。肿瘤免疫耐受机制在卵巢癌的发生发展中起着决定性的作用，与肿瘤微环境中的免疫细胞及其分泌的可溶性物质密切相关。肿瘤细胞释放自噬小体(tumor cell-released autophagosome，TRAP)是肿瘤细胞在缺氧缺营养条件下释放到细胞外基质的一种囊泡结构，作为肿瘤细胞与肿瘤微环境相互沟通的“桥梁”之一，能够与肿瘤微环境中的免疫细胞发生联系，发挥促进肿瘤的免疫耐受的功能。本文作者就TRAP在卵巢癌的发生发展中的作用及其参与肿瘤免疫耐受机制的研究进展作一综述。

1 卵巢癌微环境中的免疫耐受机制

肿瘤微环境中的免疫细胞及其分泌的可溶性分子构成复杂的网络调控结构，通过不同机制参与肿瘤的免疫耐受。参与卵巢癌免疫耐受的细胞主要包括CAFs、调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)、骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)等，通过细胞间接触和分泌可溶性分子实现与肿瘤细胞的对话。

CAFs是肿瘤微环境中的主要基质细胞。在肿瘤微环境中CAFs与肿瘤细胞之间发生对话联系，对肿瘤细胞的生长、侵袭和转移发挥重要作用。有研究发现，巨噬细胞和CAFs调控分泌ANXA6+的外泌体，这些外泌体中的ANXA6、LRP1和TSP1复合物促进肿瘤细胞摄取外泌体，ANXA6+的外泌体则能增加肿瘤细胞的恶性程度和侵袭能力[2]。此外，CAFs可以通过旁分泌途径分泌细胞因子，刺激肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞的生长转移[3]。CAFs在与肿瘤细胞的对话中募集Tregs，从而诱导肿瘤的免疫耐受。

Tregs在肿瘤微环境中发挥着免疫抑制功能，为肿瘤的免疫逃逸和免疫耐受提供条件。近些年来随着研究的不断推进，发现Tregs尤其是诱导性调节T细胞(inducible Tregs，iTregs)在多种疾病中发挥着调控作用。研究表明，CD4+CD25+FoxP3+Treg主要释放TGF-β和Il-10等细胞因子[4]，通过分泌的细胞因子以及细胞间接触发挥免疫抑制功能。同时，卵巢癌局部微环境中血管生成的增加对肿瘤特异性T细胞的浸润产生了屏障作用，从而减少了患者肿瘤中肿瘤浸润性淋巴细胞(tumoR-associated/infiltrated lymphocytes，TILs)的数量[5]。此外，TGF-β能够直接增加血管生成抑制TILs的增殖和活化，TGF-β还可以通过microRNA调控TILs表面分子的表达，抑制TILs细胞的功能。而临床研究发现CD8+TILs有利于卵巢癌的预后[6- 7]。

在机体中巨噬细胞有两种类型，即M1型和M2型。前者在免疫系统中发挥着清除病原微生物、杀伤肿瘤的作用；后者杀伤肿瘤的活性低，分泌多种可溶性物质，诱导局部免疫耐受。在肿瘤局部微环境多种细胞因子的作用下，巨噬细胞能够获得抑制性表型，向M2型分化。有研究显示，在卵巢癌组织中CD68+CD206+TAMs的比例明显高于卵巢的良性肿瘤[8]。TAMs通过分泌趋化因子促进卵巢癌细胞的浸润和转移；TAMs通过分泌VEGF、TGF-β和Il-6等多种细胞因子[9]促进肿瘤血管的形成，在肿瘤局部形成免疫屏障，发挥免疫抑制效应。

MDSCs来源于骨髓前体细胞和未成熟的髓样细胞，包括不成熟的树突状细胞(dendritic cells，DCs)、不成熟的粒细胞(granulocytes)、不成熟的巨噬细胞(macrophages)等，主要发挥免疫抑制效应。MDSCs可以通过分泌精氨酸酶降解精氨酸，而精氨酸是T细胞分化过程的重要物质，MDSCs阻断T细胞的细胞周期[10- 11]，从而影响T细胞的活性。成熟的DCs在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。成熟的DCs能够识别肿瘤抗原，通过表面的MHC分子递呈给T细胞，发挥抗肿瘤免疫。肿瘤细胞在发生发展过程中丢失肿瘤抗原,肿瘤微环境呈免疫抑制状态，从而形成肿瘤的局部免疫耐受。卵巢肿瘤免疫抑制的环境富含TGF-β、Il-10、VEGF、ARG-1等细胞因子和抑制性分子如IDO、程序性死亡受体1(programmed cell death 1，PD-1)和程 序 性 死 亡 受 体 配 体 1(programmed cell death 1 ligand 1， PD- L1)[12- 14]，影响DCs的成熟分化及迁出，使DCs多数表现出未成熟DC的特征；卵巢肿瘤免疫抑制微环境通过多种途径诱导募集未成熟的DCs和Tregs，抑制TILs细胞功能，诱导免疫耐受，促进肿瘤生长。

此外，浆细胞样DC(plasmacytoid DC，pDC)也能诱导肿瘤免疫耐受，在肿瘤免疫耐受中的作用越来越受到重视，在免疫调节中的作用也越来越受到关注。在卵巢癌中pDC诱导CD4+和CD8+Tregs分泌Il-10和VEGF刺激血管形成和血管通透性增加[13]。在44例卵巢癌患者的队列研究中，pDCs是肿瘤和恶性腹水中最丰富的DC亚群，肿瘤局部的pDCs与早期复发有相关性[15]。同时，在卵巢癌等肿瘤中，pDCs能够释放IDO，IDO是一种催化色氨酸降解的酶，促进肿瘤血管生成和肿瘤转移，下调TILs的增殖[16]，从而诱导肿瘤微环境免疫耐受。

在卵巢癌微环境中，除了肿瘤相关抑制细胞诱导免疫耐受，还存在一些抑制性分子和细胞外囊泡发挥免疫抑制功能。例如在恶性肿瘤细胞表面能够高表达PD-1，通过与T细胞表面的抑制性分子PD-L1结合抑制T细胞的杀伤功能[17]，促进肿瘤免疫耐受。

2 TRAP促进卵巢癌免疫耐受

在肿瘤微环境中，存在着多种囊泡结构桥连着肿瘤细胞与微环境中的各种基质细胞及免疫细胞。熊爱为等[18]在卵巢癌腹水中分离出微囊泡( microvesicles,MVs) ，基础实验发现，MVs能够促进卵巢癌SKOV3细胞增殖和耐药。MVs是指细胞在静息或活化状态下分泌的一种脂质双分子层膜性小囊泡,内含蛋白质、DNA、mRNA 、miRNA及lncRNA等生物活性物质。另外，外泌体——一种直径为30～150 nm[19]，形态呈球形、扁形或杯状小体的具有双层磷脂膜结构的小泡，通过携带核酸、蛋白质以及脂质等成分在肿瘤的发生发展、侵袭转移以及肿瘤免疫耐受中发挥着重要的作用[20]。Nakamura 等[21]研究发现，在卵巢癌微环境中，外泌体可以通过旁分泌的方式将丰富的细胞表面蛋白 CD44传送到腹膜间皮细胞，诱导间皮细胞表达基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9) ，参与卵巢癌肿瘤细胞的侵袭。有研究[22]显示，与正常人群相比，卵巢癌患者血清中的外泌体含量和蛋白含量明显增多，提示外泌体可作为卵巢癌的生物标志物。根据外泌体的小囊泡性质，可将其作为药物载体，增加药物的生物学利用度；此外，其内容物具有抗肿瘤作用。现阶段外泌体已成为研究肿瘤微环境的热点之一，还有文献报道，在肿瘤微环境中还存在另一种与外泌体类似却与其有着本质区别的囊泡结构——自噬小体[23]。

细胞自噬是人体一种自我保护机制，在肿瘤细胞中，在缺氧缺营养的条件下自噬会被大量激活诱导[24]。分泌自噬与经典的降解自噬不同，它不与溶酶体结合降解细胞内蛋白质和小分子，而是受到刺激后能绕过溶酶体分泌输出多种细胞内基质成分如Il-1β、HMGB1、ATP、TGF-β、溶菌酶及病菌等[25- 27]，在细胞外微环境中发挥各种各样的作用。王立新课题组发现肿瘤细胞培养上清和肿瘤患者癌性胸/腹水中存在分泌型自噬小体，直径为200～1 000 nm，具有典型的双层膜结构和表达自噬小体特异性标志蛋白LC3-Ⅱ，说明肿瘤细胞可以将分泌型自噬小体释放至细胞外，并将其命名为TRAP[23]。TRAP通过与肿瘤微环境中抑制性细胞相互联系促进肿瘤的免疫耐受。

已有研究[28]显示，在肿瘤局部微环境中，TRAP能够使标志M2型巨噬细胞的CD206显著表达，而抑制标志M1型巨噬细胞的CD86的表达，TRAP能够诱导巨噬细胞极化为M2表型的巨噬细胞，P38-STAT3信号途径促进TRAP介导的巨噬细胞的极化。TRAP诱导的巨噬细胞能大量分泌Il-10，免疫负性调节因子PD-L1的表达会大幅度增加，发挥抗肿瘤免疫效应[28]。TRAP诱导的巨噬细胞通过依赖于TLR-MyD88信号途径抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖。TRAP诱导的巨噬细胞发挥生物学效应是通过诱导PD-L1表达来抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫效应从而促进肿瘤的生长增殖。PD-L1/PD-1的高表达与临床大多数癌症的预后及药物耐药呈负相关[29]。 另有研究[23]发现，TRAP通过表面的HMGB1与B细胞表面的TLR2受体作用，通过MYD88-NF-κB信号途径激活Il-10+Breg细胞发挥免疫抑制作用。同时，TRAP通过表面的Hsp90α与初始CD4+T细胞表面的TLR2受体相互作用，使CD4+T细胞向Tfh细胞极化，TLR2-MYD88-NF-κB信号途径激活Il-10+Breg细胞发挥免疫抑制作用，分泌Il-10和Il-6，抑制T细胞免疫应答及其功能，同时抑制Th1细胞分泌IFN-γ发挥抗肿瘤效应。TRAP通过Tfh细胞诱导Il-10+Breg细胞发挥免疫抑制作用的效率明显高于TRAP直接诱导Il-10+Breg细胞，在卵巢癌腹水等临床标本中也发现有相同的免疫耐受效应[30]。

此外，TRAP能够刺激中性粒细胞表现出DNA固缩、DNA破碎，且存在剂量依赖性。同时，TRAP诱导中性粒细胞产生活性氧(ROS)(存在时间依赖性)，进一步活化caspase-3诱导中性粒细胞凋亡，并依赖细胞间直接接触方式抑制T细胞的增殖和IFN-γ的产生来发挥免疫抑制功能。完整的TRAP表面的蛋白成分介导TRAP诱导中性粒细胞凋亡；TRAP内化能够加速中性粒细胞凋亡，而不影响其自发凋亡[31]。TRAP通过不同机制与肿瘤微环境的免疫抑制细胞发生联系，抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤微环境的免疫耐受，在卵巢腹水标本中也得到了初步的验证。

3 卵巢癌的治疗进展

根据国际妇产科联合会(FIGO)分期，处于Ⅲ或Ⅳ期的患者5年生存率只有约20%[32]。目前，卵巢癌的治疗方法主要是肿瘤细胞减灭术后联合以铂为基础的联合化疗，随着卵巢肿瘤细胞减灭术等手术技术的不断提高，患者的生存质量及生存率也得到不断改善，然而大多数患者还会复发，并对常规化疗方案产生耐药性，使得卵巢癌的死亡率仍较高。

近些年，免疫疗法作为治疗卵巢癌的新型治疗方法受到了人们的广泛关注。免疫治疗又可以分为主动免疫治疗、被动免疫治疗以及联合免疫治疗，均在卵巢癌的治疗上取得了一定的效果[33]。高级别浆液性腺癌是常见的上皮性卵巢癌，目前ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)抑制剂对高级别浆液性腺癌的治疗取得了进展，效果良好。因为在高级别浆液性腺癌中存在较高的同源重组缺陷(HR)，PARP抑制剂对其效果尤为明显。PARP抑制剂通过破坏DNA修复促进肿瘤细胞的死亡[34]。目前临床上已有3种PARP抑制剂(olaparib、niraparib和rucapatib)对伴有BRCA1/2突变或铂敏感复发的上皮性卵巢癌效果显著，现在被批准用于对铂敏感和铂敏感复发患者的维持治疗[35]。此外，对于既往治疗的伴有BRCA1/2突变的铂敏感复发患者，经常规治疗完全或部分缓解以后，PARP抑制剂也被批准用于患者的积极治疗。另外，抑制免疫抑制分子PD-1/PD-L1的研究在基础研究中取得了一定程度的进步。在应用于临床过程中PD-1抑制剂单药对患者的治疗效果欠佳，为了增强上皮性卵巢癌患者对免疫治疗的效果，推行了多种联合治疗方案，且效果较单药好，例如PD-1抑制剂联合VEGF抑制剂、PD-1抑制剂联合PARP抑制剂等[36]。免疫疗法的前景广阔，但患者之间肿瘤微环境免疫抑制的个体差异较大，导致肿瘤免疫疗法的效果不尽人意。

综上所述，免疫疗法已成为近些年临床研究的热点，并在免疫治疗的各个方面取得了重要进展。研究表明，TRAP作为肿瘤细胞与肿瘤微环境中的重要通讯信使，通过不同的机制在肿瘤微环境中行使免疫抑制功能，促进机体免疫耐受。然而，靶向阻断TRAP是否能够调节肿瘤免疫耐受，是否对肿瘤的治疗起到重要的辅助作用，还需进一步研究与验证。晚期卵巢癌是死亡率较高的恶性肿瘤，除常规的治疗方式，免疫治疗存在更广泛的前景。进一步了解卵巢癌微环境的复杂网络调控系统，深入探究卵巢癌微环境的免疫耐受机制，研究TRAP在卵巢癌微环境中发挥作用的机制，能够对卵巢癌的免疫治疗起到指导作用，为卵巢癌的靶向治疗提供理论依据。